付 林，陳遠(yuǎn)華，于 震，王 華，趙 卉，徐德祥

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，安徽 合肥 230041; 2.安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，安徽 合肥 230031)

胎兒宮內(nèi)生長受限(fetal intrauterine growth restriction，IUGR) 是指胎兒未能達(dá)到其遺傳決定的全部生長潛能[1]。IUGR不僅與死胎風(fēng)險的增加有關(guān)，同時也是造成圍產(chǎn)期胎兒高發(fā)病率和死亡率主要原因[2]。維生素D (vitamin D，VD)是一種甾體類固醇激素，近年來母體孕期維生素D缺乏(vitamin D deficiency，VDD)與IUGR的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注，流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)孕期VDD增加了IUGR的發(fā)生風(fēng)險[3]，但是機(jī)制不清。因此，本研究旨在通過低維生素D飼料喂養(yǎng)構(gòu)建VDD誘發(fā)IUGR孕鼠模型，并從胎盤糖皮質(zhì)激素屏障功能方面探討VDD誘發(fā)IUGR的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑本研究所用小鼠均為SPF級CD-1小鼠，購于北京維通利華公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2017-0012。4周齡雌鼠體重(19～21)g，飼養(yǎng)在恒溫恒濕環(huán)境中，自由飲水和進(jìn)食，維持恒定晝夜節(jié)律。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周以后，隨機(jī)均勻分成對照組(CTRL組)和維生素D缺乏組(VDD組)。正常飼料和低維生素D飼料購買于南京特洛菲公司。糖皮質(zhì)激素試劑盒購買于武漢華美生物公司。小鼠11β-HSD2引物由上海生工技術(shù)有限公司合成。一抗購于美國Abcam公司。

1.2 動物模型的制備實驗動物隨機(jī)分為2組：對照組(CTRL組)、維生素D缺乏組(VDD組)，每組雌鼠40只。CTRL組小鼠喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料(VD含量>800 IU·kg-1)，VDD組小鼠飼養(yǎng)在無紫外光照的房間中，并喂以低維生素D飼料(VD含量<25 IU·kg-1)。飼養(yǎng)5周以后，每組隨機(jī)取6只雌鼠，異氟烷麻醉小鼠，摘眼球取血、脫臼處死小鼠，檢測血清中25-(OH)-D水平。剩余36只雌鼠與正常雄鼠交配，在妊娠d 16剖殺6只孕鼠，留取胎盤；在妊娠d 19剖殺剩余孕鼠，觀察妊娠結(jié)局。

1.3 蛋白免疫印跡取胎盤勻漿，吸取上清液并離心，吸取上清液250 μL，煮沸變性，所得即為胎盤總蛋白。接下來進(jìn)行SDS-PAGE電泳，組裝灌膠卡槽，灌入合適高度的分離膠和濃縮膠。然后使用微量進(jìn)樣器加入等量的蛋白樣品，開始電泳。電泳結(jié)束后剪下所需分子量的凝膠，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，孵育一抗和二抗，發(fā)光顯影、拍照并分析灰度值。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附實驗所有試劑盒于室溫中復(fù)溫30 min，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。在酶標(biāo)板中加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測血清，孵育一抗和二抗，加入顯色液繼續(xù)反應(yīng)，最后用酶標(biāo)儀檢測吸光度值[4]。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)取胎盤加入TRIzol勻漿，用氯仿萃取RNA，加入異丙醇，輕輕顛倒搖晃EP管。然后4 ℃ 15 000×g離心10 min，留下沉淀，干燥RNA。加入適量無酶水，溶解RNA并定量至500 μg·L-1。取2 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)結(jié)束進(jìn)行后續(xù)的PCR實驗[5]。

2 結(jié)果

2.1 孕期維生素D缺乏誘發(fā)IUGR維生素D缺乏 (VDD)飼料喂養(yǎng)小鼠，5周后檢測血清25-(OH)-D水平。結(jié)果Tab 1所示，VDD組小鼠血清中25-(OH)-D水平低于CTRL組(5 μg·L-1vs23 μg·L-1)。在孕d 19剖殺孕鼠，發(fā)現(xiàn)兩組孕鼠在活胎、死胎以及吸收胎上無差異。稱量胎鼠重和胎盤重，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VDD組胎鼠重和胎盤重低于CTRL組。此外，VDD組胎鼠身長和胎盤直徑均低于CTRL組,見Tab 1。

Tab 1 The pregnancy outcome of mice in two

2.2 孕期維生素D缺乏損傷胎盤糖皮質(zhì)激素屏障功能我們檢測了胎盤11β-HSD2的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VDD組胎盤11β-HSD2蛋白和mRNA水平低于CTRL組；此外，胎血中糖皮質(zhì)激素水平也被檢測，我們發(fā)現(xiàn)VDD組胎鼠中GC水平高于CTRL組[(315.6±18.32) ng·L-1vs(506.3±23.46) ng·L-1]。

3 討論

本研究通過低維生素D飼料喂養(yǎng)成功構(gòu)建VDD小鼠模型，發(fā)現(xiàn)VDD組和CTRL組在活胎、死胎以及吸收胎數(shù)上無差異；孕期VDD減輕了胎鼠和胎盤重，降低了胎鼠身長和胎盤直徑。以上結(jié)果表明，母體孕期VDD可誘發(fā)IUGR，但機(jī)制不明。Ⅱ型11β-羥基固醇脫氫酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenase 2, 11β-HSD2)是一類重要的糖皮質(zhì)激素代謝酶。研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，胎盤11β-HSD2能夠代謝有生物學(xué)活性的皮質(zhì)醇為無生物學(xué)活性的皮質(zhì)酮，預(yù)防母體內(nèi)過多的GC透過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，維持正常發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)11β-HSD2表達(dá)在VDD組胎盤上降低，GC水平升高。以上結(jié)果提示，母體孕期VDD可能通過下調(diào)胎盤11β-HSD2表達(dá)，導(dǎo)致母體內(nèi)過多GC進(jìn)入到胎兒體內(nèi)進(jìn)而誘發(fā)IUGR。