吳欣妍，焦 運，王青青，徐 龍，張 輝,郭 偉，楊安寧，郝銀菊，姜怡鄧

(寧夏醫(yī)科大學 1.基礎醫(yī)學院、2.國家衛(wèi)生健康委代謝性心血管疾病研究重點實驗室、3.寧夏血管損傷與修復研究重點實驗室、4.總醫(yī)院感染科、5.藥學院，寧夏回族自治區(qū)，寧夏 銀川 750004)

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是甲硫氨酸代謝過程中的產物，血漿中Hcy的濃度超過15μmol/L定義為高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)[1]。肝臟作為Hcy代謝的重要臟器，Hcy的水平增加與肝臟損傷密切相關[2]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Hcy水平增加能夠通過促進肝細胞大量凋亡引起肝臟損傷[3-6]。目前認為，自噬是一種至關重要的溶酶體降解途徑，主要通過細胞器或蛋白質的降解來保證細胞功能，其特征是通過細胞的降解和循環(huán)形成新的細胞，病理狀態(tài)下，細胞內過度自噬對細胞的損傷起著關鍵作用[7],因此，探討HHcy通過自噬引起肝損傷的發(fā)生機制至關重要。大量研究表明，26S蛋白酶體非ATP酶調節(jié)亞基10(proteasome 26S subunit, non-ATPase, 10，PSMD10)在肝細胞增殖、侵襲和凋亡中起著重要的調控作用[8]。Sun等[9]研究發(fā)現(xiàn)PSMD10的過度表達減弱原代肝細胞的增殖，促進肝細胞凋亡，說明PSMD10在肝臟中過表達與肝臟的損傷密切相關。但是，在HHcy中，PSMD10是否通過調控肝細胞自噬引起肝損傷是未知的。因此探討PSMD10在HHcy致肝損傷過程中的作用及其與肝細胞自噬的調控關系將為肝臟損傷的防護提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料BS110S型精密天平(Sartorius)；超凈工作臺(安泰技術有限公司)；電泳儀和凝膠成像儀(Bio-Rad)；普通PCR儀和qRT-PCR儀(德國耶拿)；總RNA提取試劑盒(DP419,北京天根生物技術有限公司)；逆轉錄試劑盒(RR037A，日本Takara)；酶標儀(美國Bio-TEK)；Anti-PSMD10、Anti-LC3B和Anti-p62(ab182576，ab192890，ab56416美國Abcam)；PSMD10引物(上海生工)；ALT和AST ELISA試劑盒(JL45794，JL12187，上海信裕生物)，全自動生化分析儀(美國強生)。

1.2 方法

1.2.1動物分組及飼養(yǎng) 實驗動物購于美國Jackson實驗室。隨機選取野生型小鼠(cbs+/+，n=8)及cbs基因敲除小鼠(cbs+/-，n=8)均給予高蛋氨酸(2%高蛋氨酸)飲食，2組小鼠飼養(yǎng)在屏障環(huán)境中，自由攝食飲水，12周后處理取材用于后續(xù)實驗。

1.2.2細胞培養(yǎng)及分組 用含10%胎牛血清及1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液，于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)正常人源肝細胞(HL-7702)，用含終濃度100μmol·L-1Hcy培養(yǎng)液干預細胞48 h，用于后續(xù)實驗。

1.2.3細胞轉染 PSMD10 siRNA 在1.5 mL EP管中加入250 μL的1640純培養(yǎng)基(不含血清，不含抗生素)，隨后加入0.5OD 6.25 μL的PSMD10 siRNA，混勻。在另一個1.5 mL EP管中加入250 μL純培養(yǎng)基和5 μL的Lipofectamine 2000，混勻靜置5 min。之后混勻兩管液體，靜置20 min。將六孔板中培養(yǎng)基棄掉，加入1.5 mL的純培養(yǎng)基，20 min過后，將混合的液體500 μL液體全部加入到六孔板中。6 h后，換做正常的培養(yǎng)基，并加入Hcy藥物干預，48 h后進行后續(xù)其他實驗。

1.2.4細胞轉染 PSMD10過表達腺病毒 將10 μL的腺病毒加入25 cm2的培養(yǎng)瓶中，加入4 mL正常培養(yǎng)基，6 h后換培養(yǎng)基，48 h后熒光顯微鏡觀察轉染效率。

1.2.5ELISA檢測肝細胞培養(yǎng)液上清中的AST和ALT 按照試劑盒說明收集樣本，制備標準品；加樣：分別設標準品孔，空白孔和樣本孔各加不同濃度的標準品50 μL，樣本孔中加待測樣本50 μL，空白孔加樣本稀釋液50 μL。用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后進行洗滌，隨后每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔除外，再次進行溫育和洗滌，加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，混勻后孵育15 min，每孔加終止液50 μL，終止反應，450 nm波長處檢測吸光度值。

1.2.6qRT-PCR檢測肝臟和肝細胞中PSMD10的表達 按RNA提取試劑盒說明書提取小鼠肝臟和肝細胞中的總RNA，逆轉錄合成cDNA。引物交由上海生工設計，PSMD10(人源)Forward：GTGCCAGTGAATGATAAAGACG，Reverse：TGTAAGGGAGTACAGCCATTTT；PSMD10(鼠源)Forward：GAGGGGTGTGTGTCTAACATAA，Reverse：GTCCTGATCAGTTCTAGTAGCC。PCR擴增條件為: 95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性10 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延長 30 s，45個循環(huán)。反應結束后，根據擴增曲線數據，按照計算公式: 2-ΔΔCt(ΔCt=Ct目的-Ct內參，ΔΔCt=ΔCt-10)分析PSMD10的表達量。實驗重復3次。

1.2.7Western blot法檢測PSMD10、LC3B、P62的蛋白表達 將干預好的細胞裂解變性，取30 μg總蛋白上樣，經 SDS/PAGE 凝膠電泳，電轉至PVDF 膜，封閉后，與1 ∶1 000 稀釋的一抗4 ℃孵育過夜，再與1 ∶5 000稀釋的二抗室溫孵育2 h，PBST清洗3次，每次10 min，曝光。用凝膠圖像分析成像系統(tǒng)進行掃描分析，結果以目的條帶面積灰度值做半定量檢測。

2 結果

2.1 測定小鼠血清和肝細胞培養(yǎng)液上清中AST和ALT為了驗證Hcy引起肝臟損傷，使用全自動生化分析儀檢測小鼠血清中AST和ALT；100 μmol·L-1Hcy干預肝細胞48 h，ELISA檢測肝細胞培養(yǎng)液上清的中AST和ALT水平，檢測結果顯示，cbs+/-小鼠血清中AST和ALT的水平高于cbs+/+小鼠(P<0.01，F(xiàn)ig 1A，B)，Hcy組肝細胞培養(yǎng)液上清中AST和ALT的水平的高于control組(P<0.01，F(xiàn)ig 1C，D)，表明Hcy能夠的引起肝臟的損傷。

Fig 1 Changes of AST and ALT levels in mouse serum and hepatocyte culture supernatantA and B: Contents of ALT and AST in serum of mice were analyzed using automatic biochemical analyzer n=3). **P<0.01 vs cbs+/+ or control group.

2.2 Hcy引起肝損傷過程中自噬相關蛋白LC3B與p62的表達情況為了驗證自噬在Hcy致肝損傷過程中的變化，使用Western blot檢測肝臟和肝細胞中自噬相關蛋白LC3B與p62的表達改變，檢測結果顯示cbs+/-小鼠較cbs+/+小鼠肝臟相比，LC3Ⅱ/Ⅰ的比值增加，p62的表達降低(P<0.01，F(xiàn)ig 2A)；Hcy干預肝細胞后，與control組相比，LC3Ⅱ/Ⅰ的比值增加，p62的表達降低(P<0.01，F(xiàn)ig 2B)。細胞水平與動物水平變化一致，表明Hcy促進肝細胞自噬水平增加。

2.3 PSMD10在小鼠肝臟及肝細胞中的表達改變?yōu)榱嗣鞔_PSMD10在Hcy引起肝損傷過程中的作用，使用qRT-PCR和Western blot檢測肝臟和肝細胞中PSMD10 mRNA和蛋白的表達改變。檢測結果顯示，cbs+/-小鼠肝臟中PSMD10 mRNA和蛋白的表達水平均高于cbs+/+小鼠肝臟(P<0.05，P<0.01，F(xiàn)ig 3A)；Hcy干預肝細胞后，與control組相比，Hcy組肝細胞中PSMD10 mRNA和蛋白的表達增加(P<0.01，F(xiàn)ig 3B)。以上結果說明，Hcy能夠促進PSMD10在肝細胞中表達增加。

2.4 觀察 PSMD10 在Hcy誘導肝細胞自噬的情況為進一步驗證PSMD10是否調控Hcy誘導的肝細胞自噬，肝細胞轉染PSMD10 siRNA并用Hcy干預48 h后，Western blot檢測PSMD10蛋白表達改變，結果顯示PSMD10敲低成功如Fig 4A所示，通過Western blot檢測肝細胞中自噬相關蛋白LC3B與p62的表達改變，結果顯示，與Hcy+siNC組相比，Hcy+siPSMD10組LC3Ⅱ/Ⅰ的比值降低，p62的表達增加(P<0.05，P<0.01，F(xiàn)ig 4B)；為進一步驗證PSMD10調控肝細胞自噬的功能，感染PSMD10過表達腺病毒(ad-PSMD10)，熒光顯微鏡觀察感染效率，qRT-PCR和Western blot檢測肝細胞過表達PSMD10后自身表達改變，如Fig 4C，D所示，肝細胞PSMD10過表達腺病毒感染成功；進一步使用Western blot檢測LC3B和p62的表達改變，結果表明，與ad-GFP組相比，ad-PSMD10組LC3Ⅱ/Ⅰ的比值增加，p62的表達降低(P<0.01，F(xiàn)ig 4E)。該結果表明，PSMD10增加引起肝細胞自噬，敲低PSMD10后能夠緩解Hcy誘導的肝細胞自噬。

Fig 2 The protein expression of LC3B and p62 in liver and hepatocytes detected by Western blotA： The protein expression of LC3B and p62 in the liver tissues of cbs+/+ and cbs+/- mice was detected by Western blot n=3). **P<0.01 vs cbs+/+or control group.

Fig 3 Expression of PSMD10 in liver and hepatocytes detected by Western blot and qPT-RCRA： The expression of PSMD10 mRNA and protein in liver tissues were detected by qRT-PCR and Western n=3). *P<0.05, **P<0.01 vs cbs+/+ or control group.

Fig 4 Changes of autophagy levels in hepatocytes after knockdown or overexpression of PSMD10A： Hepatocytes were transfected with PSMD10 siRNA, and the expression of PSMD10 was detected by Western blot ; B： Hepatocytes were transfected with PSMD10 siRNA, and the expression of LC3B and p62 were detected by Western blot; C： Hepatocytes were infected with PSMD10 overexpressing adenovirus, and infection efficiency was observed by fluorescence microscope; D： Hepatocytes were infected with PSMD10 overexpressing adenovirus, and the expression of PSMD10 was detected by qRT-PCR and Western blot ; E： Hepatocytes were infected with PSMD10 overexpressing adenovirus, and the expression ofLC3B and p62 were detected by Western blot*P<0.05, **P<0.01 vs Hcy+siNC or ad-GFP group.

2.5 PSMD10在Hcy誘導肝細胞損傷中的作用為進一步驗證PSMD10通過自噬途徑調控Hcy誘導的肝損傷，肝細胞轉染PSMD10 siRNA，Hcy干預肝細胞48h后，使用ELISA檢測肝細胞培養(yǎng)液上清中AST和ALT水平，檢測結果顯示，與Hcy+siNC組相比，Hcy+siPSMD10組肝細胞培養(yǎng)液上清中AST和ALT水平降低(Fig 5A和B，P<0.01)，為進一步驗證PSMD10對肝細胞損傷的調控，肝細胞感染PSMD10過表達腺病毒，使用ELISA檢測肝細胞培養(yǎng)液上清中AST和ALT水平，檢測結果顯示，與ad-GFP組相比，ad-PSMD10組AST和ALT水平增加(Fig 5C，P<0.01)。該結果表明敲低PSMD10后能夠抑制Hcy引起的肝細胞損傷，過表達PSMD10，肝細胞損傷明顯增加。以上結果說明PSMD10經自噬途徑調控Hcy引起的肝損傷。

Fig 5 Changes of hepatocyte injury after knocking down or overexpressing PSMD10A and B: Knock down the expression of PSMD10 in hepatocytes, expression levels of AST and ALT in the supernatant of hepatocyte culture medium were detected by ELISA ; C: Overexpression the PSMD10 in hepatocytes, expression levels of AST and ALT in the supernatant of hepatocytes culture medium were detected by ELISA n=3); **P<0.01 vs Hcy+siNC or ad-GFP group.

3 討論

同型半胱氨酸(Hcy)濃度升高是心血管疾病如冠心病、高血壓和中風等的獨立危險因素，Hcy在體內主要通過再甲基化和轉硫這兩種重要方式代謝，Hcy的轉硫途徑在肝臟中發(fā)揮至關重要的作用，主要受到胱硫酶醚合成酶(CBS)的調節(jié)，當CBS的活性降低，Hcy不能夠充分的通過轉硫途徑轉換為胱硫醚，從而在體內蓄積引起肝臟損傷[10-12]。大量的研究顯示，高水平的Hcy與酒精性肝硬化、慢性肝病、肝炎等疾病密切相關[13]，肝臟功能障礙導致蛋氨酸代謝異常，出現(xiàn)Hcy升高，當Hcy水平增加又會進一步的損害肝臟的功能，本實驗結果顯示，使用cbs+/-小鼠高蛋氨酸飲食后，cbs+/-小鼠血清中AST與ALT水平明顯上升，在細胞水平也進一步證明了在Hcy刺激肝細胞后，肝細胞上清中的AST和ALT顯著增加，說明，Hcy顯著引起肝臟損傷，肝細胞受損。課題組前期的大量工作也證明HHcy小鼠出現(xiàn)顯著的肝臟損傷，Hcy能夠通過促進肝細胞大量凋亡和異常的自噬等途徑造成肝臟的損傷[3-6]。

自噬是一種自我保護機制，維持細胞穩(wěn)態(tài)和細胞器的完整性[14]。自噬在調節(jié)肝臟生理和平衡肝臟代謝中起著至關重要的作用[15]；課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CFTR能夠通過調控肝細胞自噬調控肝臟的損傷[6]，本實驗研究結果也表明，cbs+/-小鼠肝臟和Hcy組肝細胞中，LC3Ⅱ/Ⅰ的比值增加，p62的表達明顯降低，進一步的驗證Hcy能夠促進肝細胞大量自噬造成肝臟損傷。

有研究表明，在饑餓或壓力的條件下，PSMD10能夠通過與細胞質中的ATG7以及核熱激轉錄因子1(HSF1)協(xié)同結合作用促進肝細胞癌(HCC)中的自噬[16]。本研究結果顯示，在cbs+/-小鼠肝臟和Hcy組肝細胞中，PSMD10的mRNA和蛋白的表達均明顯增加，說明PSMD10可能與Hcy引起的肝臟損傷密切相關。Zhao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，當構建肝臟特異性PSMD10過表達小鼠，肝臟出現(xiàn)損傷，這進一步的證明在PSMD10與肝臟損傷過程中表達增加。本實驗發(fā)現(xiàn)當肝細胞中敲低PSMD10的表達后，Hcy誘導的肝細胞自噬和肝損傷降低，PSMD10過表達后，肝細胞自噬水平增加，肝細胞損傷加重，說明PSMD10通過調控肝細胞自噬進而調控Hcy所引起的肝損傷。有研究報道顯示，Linc-GALH可以通過調節(jié)DNMT1的泛素化調控PSMD10的甲基化狀態(tài)，從而調節(jié)PSMD10的表達，調控肝癌細胞的增殖和轉移[18]。課題組前期也證明，Hcy上調肝細胞中DNMT1的表達，通過DNA甲基化和組蛋白甲基化調控肝細胞損傷[6]，這進一步的證明Hcy通過調控PSMD10激活肝細胞自噬造成肝臟損傷。

綜上所述，Hcy誘導的肝細胞過度自噬促進PSMD10表達增加，進而導致肝損傷。這為臨床治療Hcy所引起的肝損傷提供了新的治療思路。