宋曉妹，楊 紅，龍秋雙，方官琴，高 歌, 甘詩泉，陳 妍，沈祥春

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評價重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3. 貴陽市婦幼保健院藥學(xué)部，貴州 貴陽 550003)

糖尿病患病率和相關(guān)死亡率不斷上升。全世界的糖尿病患者人數(shù)預(yù)計將從2017年的4.51億增加至2045年的6.93億。2017年，全球20-99歲年齡段的糖尿病死亡人數(shù)約為500萬[1]。這一新的預(yù)測使我們警惕糖尿病給全世界人類帶來了巨大的社會、財務(wù)和衛(wèi)生系統(tǒng)負擔(dān)。超過68%的糖尿病病人最終死于心血管系統(tǒng)并發(fā)癥，糖尿病心血管并發(fā)癥已成為糖尿病致死與致殘的主要原因[2]，而血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)與功能的異常是血管并發(fā)癥的前提與基礎(chǔ)[3]。因此，尋找改善血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)病機制和保護性分子機制已成為近年來研究的重點。

自噬是一種進化上保守的分解代謝過程，它以溶酶體依賴性的方式介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解，細胞器周轉(zhuǎn)和細胞質(zhì)含量的循環(huán)[4]。最近的研究表明，自噬失調(diào)與幾種心血管病理過程有關(guān)，例如糖尿病心血管疾病、動脈粥樣硬化，心臟肥大和心肌病[5-6]。自噬流是細胞穩(wěn)態(tài)的參數(shù)之一，它是自噬小體生物發(fā)生(多種自噬蛋白的隔離和膜狀結(jié)構(gòu)的形成)和封閉內(nèi)容物降解之間的平衡。自噬流障礙會引起非必要的貨物積累，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙和異位脂質(zhì)蓄積。相反地，自噬流通暢可改善代謝性疾病和心血管功能[7]。血管內(nèi)皮細胞因其存在的廣泛性和敏感性，會隨著外界環(huán)境的改變而發(fā)生功能改變，并且伴隨著自噬的產(chǎn)生。但自噬在血管內(nèi)皮細胞中所扮演的角色及具體調(diào)控機制尚不明確。

1,8-桉葉油素(1,8-Cineole)是一種單萜，存在于許多植物精油中，例如迷迭香和艷山姜揮發(fā)油[8]。1,8-Cineole具有抗氧化、抗炎、抗高血壓和改善血管內(nèi)皮損傷作用，其是用于阿爾茨海默氏病、癌癥、呼吸系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、心血管疾病、煩躁不安和桿菌的潛在治療劑[9]，但在心血管疾病研究主要集中在抗氧化和抗炎方面，對自噬的研究尚少。本文旨在探討1,8-Cineole是否通過自噬來改善高糖誘導(dǎo)HAECs損傷，為1,8-Cineole防治糖尿病心血管疾病提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器Heal force型細胞培養(yǎng)箱(中國上海力申科學(xué)儀器有限公司)、RM-220實驗室專用超純水機(沃特浦公司)、700-SERIES超低溫冰箱(Thermo SCIEMTIFIC)、LS-R35L-I立式壓力蒸氣滅菌器(江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司)、SW-CJ-2F單人雙面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)和5810R型冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 試劑及藥物

1.2.1試劑 原代人主動脈內(nèi)皮細胞(HAECs，6100)購自ScienCell Research Laboratories、Endothelial Cell Medium(ECM，1001)購自 Sciencell technology，ECM中含有5.5 mmol·L-1葡萄糖；乳酸脫氫酶試劑盒(A020-2)購自南京建成生物工程研究所；LC3(14600-1-AP，1 ∶1 000)、SQSTM1/p62 (18420-1-AP，1 ∶1 000)、caspase-3(66470-2-1g，1 ∶1 000)、caspase-9(10380-1-AP，1 ∶1 000)購自Proteintech公司、Beclin1(ab207612，1 ∶1 000)購自Abcam公司。D-glucose(405A0918)和D-mannitol(1126F038)購自北京索萊寶科技有限公司；1,8-Cineole(Eucalyptol，K1822141)購自阿拉丁公司。

1.2.2藥物配制 精密吸取1,8-Cineole(純度>99%)10 μL稱重，溶于990 μL二甲基亞砜，0.22 μm濾頭過濾除菌配制成濃度為9.405×106μg·L-1的母液，分裝后置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。臨用時用2% ECM稀釋成所需濃度。

1.3 細胞培養(yǎng)及分組HAECs采用(含有5% FBS、1%雙抗、1%血管內(nèi)皮生長因子)ECM培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。實驗分為兩部分，(1)：正常對照組(Control，5. 5 mmol·L-1葡萄糖)、甘露醇作為滲透壓對照組(MA， 29. 5 mmol·L-1甘露醇+ 5. 5 mmol·L-1葡萄糖)、高糖組(HG，35 mmol·L-1葡萄糖)、藥物1,8-Cineole 低劑量組(0.25 μg·L-11,8-Cineole(CL)+HG)、藥物1,8-Cineole 高劑量組(2.5 μg·L-11,8-Cineole(CH)+HG)。各給藥組預(yù)處理1 h 后，加入HG共同孵育60 h 建立HAECs損傷模型。(2)：對照組(Control，5. 5 mmol·L-1葡萄糖)、高糖組(HG，35 mmol·L-1葡萄糖)、1,8-Cineole 高劑量組 (2.5 μg·L-11,8-Cineole(CH)+HG)、自噬抑制劑(10 μmol·L-1氯喹(CQ))組、CQ+HG共給藥組、CQ+HG+CH 3者聯(lián)用組。各給藥組或抑制劑組預(yù)處理 1 h 后，加入HG共同孵育60 h，根據(jù)實驗需要對細胞進行相應(yīng)的處理。

1.4 MTT法檢測細胞活力以1×108個·L-1密度的細胞接種于96孔板中，采用MTT法檢測細胞活性。計算公式：細胞存活率/%=各組OD值/對照組OD值×100%。

1.5 LDH檢測細胞毒性收集各處理組細胞上清液，根據(jù)南京建成LDH檢測試劑盒使用明書進行實驗操作，計算細胞上清液中LDH含量。

1.6 Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達分別收集各處理組的細胞，加入細胞裂解液，其中PMSF占總體積1%，RIPA 占總體積99%來提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)進行定量，規(guī)定上樣質(zhì)量30 μg后進行分裝。經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到0.22 μm PVDF膜上，采用2%牛血清白蛋白(BSA)進行室溫1 h封閉。加入相應(yīng)一抗，置于4 ℃冰箱孵育過夜，次日從冰箱拿出膜于搖床上搖0.5 h后,回收一抗，1 × TBST洗膜3次后，加入二抗室溫孵育，1 h后回收二抗，洗膜3次。采用化學(xué)發(fā)光液在暗室顯影。

2 結(jié)果

2.1 1,8-Cineole增強HAECs活力和減輕高糖誘導(dǎo)的細胞毒性MTT結(jié)果顯示，高糖孵育細胞60 h后，HG組細胞活力明顯降低(P<0.05)，如Fig 1A所示，1,8-Cineole組以劑量依賴性增強細胞活力(P<0.05，與HG模型組比較)；HG模型組與Control組比較，LDH含量增加(P<0.05)；1,8-Cineole組與HG模型組比較，LDH含量減少(P<0.05)且呈劑量依賴性，如Fig 1B所示。

Fig 1 A. Cell viability enhanced by 1,8-Cineole n=3); B. HG-induced cytotoxicity reduced by 1,8-Cineole n=3)*P<0.05 vs Control; #P<0.05 vs HG.

2.2 1,8-Cineole改善HG誘導(dǎo)HAECs的自噬抑制與Control組比較，HG組抑制 Beclin1和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白的表達(P<0.05)，促進p62蛋白的表達(P<0.05)；與HG組相比較，1,8-Cineole處理后可上調(diào)Beclin1 和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白的表達和下調(diào)p62蛋白的表達(P<0.05)。結(jié)果表明1,8-Cineole可激活自噬，使自噬流通暢，如Fig 2所示。

Fig 2 Effect of 1,8-Cineole on HG-induced *P<0.05 vs Control; #P<0.05 vs HG.

2.3 1,8-Cineole抑制HG誘導(dǎo)HAECs的凋亡如Fig 3所示，Western blot結(jié)果表明，與Control組比較，HG組促進caspase-9和caspase-3蛋白上調(diào)(P<0.05)；與HG組比較，1,8-Cineole組二者表達都下調(diào)(P<0.05)。結(jié)果說明，1,8-Cineole可抑制HG誘導(dǎo)細胞的凋亡。

2.4 1,8-Cineole通過調(diào)節(jié)自噬流改善HG誘導(dǎo)自噬抑制溶酶體抑制劑氯喹(CQ)，可導(dǎo)致自噬流障礙，從而使自噬小體積聚增加。在本研究中，Western blot結(jié)果顯示，CQ組與Control組相比，Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ和p62表達進一步上調(diào)(P<0.05)；CQ+HG+CH組與CQ+HG組比較時三者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，如Fig 4所示。結(jié)果表明，給予自噬抑制劑CQ，發(fā)現(xiàn)1,8-Cineole對HAECs自噬的改善作用被CQ完全減弱，提示1,8-Cineole通過調(diào)節(jié)自噬流改善HG誘導(dǎo)自噬抑制。

Fig 3 HG-induced cell apoptosis inhibited by *P<0.05 vs Control; #P<0.05 vs HG.

Fig 4 Effect of autophagy inhibitors on 1,8-Cineole in improving autophagy n=3)*P<0.05 vs Control; #P<0.05 vs HG.

2.5 1,8-Cineole通過調(diào)節(jié)自噬流障礙改善HG誘導(dǎo)HAECs的凋亡給予自噬抑制劑CQ干預(yù)后，caspase-9和caspase-3較Control組明顯上調(diào)(P<0.05)；CQ+HG+CH組與CQ+HG組比較時二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，如Fig 5所示。結(jié)果表明，1,8-Cineole通過調(diào)節(jié)自噬流障礙改善HG誘導(dǎo)HAECs的凋亡。

Fig 5 HG-induced apoptosis improved by 1, 8-Cineole via regulating autophagic n=3)*P<0.05 vs Control; #P<0.05 vs HG.

3 討論

隨著人口老齡化的加劇以及生活方式的改變，心血管疾病成為嚴重威脅人類健康的重要疾病之一，在近幾年的流行病調(diào)查中，因心血管疾病死亡人數(shù)一直高居因病死亡的榜首，因此，心血管疾病的預(yù)防和治療便成為現(xiàn)階段各國科研和臨床研究的重點[10]。研究顯示[11]，心臟、血管是糖尿病的主要靶器官，其中約2/3的糖尿病患者死于心血管疾病。糖尿病與心血管疾病的發(fā)生具有密切的關(guān)系，一旦發(fā)生心血管疾病后會對心臟、血管造成持續(xù)性損害，嚴重影響患者預(yù)后。

血管內(nèi)皮細胞在維持心血管系統(tǒng)正常功能中起著關(guān)鍵作用，而內(nèi)皮功能障礙已被認為是幾乎所有心血管疾病的常見危險因素[12]。在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病過程中，自噬對血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞起到了保護的作用。自噬是一種細胞自我保護機制，通過這種機制，細胞通過分類為大自噬的溶酶體依賴性機制降解受損的蛋白質(zhì)和大分子。該過程涉及幾個步驟，包括引發(fā)、延伸、成熟、融合和降解。起始時，在細胞質(zhì)成分周圍形成一個熒光團，然后被一個雙層膜隔離，形成一個自噬體。隨后，自噬體與溶酶體融合形成自溶體，封閉的內(nèi)容物隨后降解[13]。Beclin-1 是自噬啟動的必需基因，通過與Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(Ⅲ PI3K)結(jié)合形成Beclin1-Ⅲ PI3K復(fù)合物，調(diào)節(jié)自噬的水平。Beclin-1是第1個被發(fā)現(xiàn)的參與自噬對疾病調(diào)控的自噬基因，在自噬溶酶體降解途徑中對腫瘤有抑制作用。LC3是自噬體膜的重要標(biāo)記物，以LC3Ⅰ和LC3 Ⅱ兩種形式存在，LC3在羧基端被具有蛋白內(nèi)切酶活性的Atg4剪切，生成存在于細胞質(zhì)的LC3Ⅰ；LC3Ⅰ通過Atg7和Atg3參與的泛素樣反應(yīng)，使磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)，生成脂質(zhì)化形式的LC3 Ⅱ；LC3Ⅱ是自噬體的結(jié)構(gòu)蛋白，可以附著到自噬體膜上，通過監(jiān)測LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化可以檢測自噬的進展，所以通常用Western blot檢測LC3-Ⅱ/Ⅰ或mRFP-GFP-LC3雙熒光實驗評估自噬的表達[14]。p62是將LC3與泛素化底物連接的自噬的重要指標(biāo)。p62被多泛素化蛋白轉(zhuǎn)移到自噬體中，并在自溶酶體中降解。當(dāng)在哺乳動物細胞中抑制自噬時，p62的表達增加[15]。自噬紊亂可能是多種疾病的發(fā)病機理，包括心血管疾病，代謝性疾病，腎臟疾病，炎癥，癌癥以及神經(jīng)退行性疾病。Ye等[16]研究提示，敲除Beclin 1(自噬啟動形成的關(guān)鍵組成部分)會加劇大鼠頸動脈損傷后新內(nèi)膜的形成，這與延遲的內(nèi)皮化有關(guān)。Beclin1是哺乳動物自噬基因，對自噬調(diào)節(jié)至關(guān)重要。最新研究表明，用30 mmol·L-1葡萄糖處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)后p62的表達增加，但抑制LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達，透射電子顯微鏡顯示，HUVEC膜中自噬泡的減少[17]。在本研究中，HG處理細胞60 h后，檢測到Beclin1和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平降低，p62表達增加，與文獻報道結(jié)果一致；文獻顯示，使用自噬抑制劑抑制巨噬細胞自噬，由于線粒體膜穩(wěn)定性降低或半胱天冬酶抑制作用降低，可增強凋亡誘導(dǎo)的細胞死亡[18]，在本文中，HG處理細胞后，caspase-3和caspase-9表達增加，在給予自噬抑制劑CQ干預(yù)細胞后，觀察到caspase-3和caspase-9表達進一步增加，表明CQ促進細胞凋亡。因此篩選有效的天然活性物質(zhì)調(diào)控自噬改善高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙是防治糖尿病心血管并發(fā)癥的重要策略。

1,8-Cineole是從植物精油中提取的單體化合物，目前1,8-Cineole在心血管藥理學(xué)研究報道盡顯稀缺。本研究結(jié)果表明，高糖作用HAECs 60 h后，誘導(dǎo)細胞活力下降、增加LDH含量、抑制自噬和促進細胞凋亡，在給予1,8-Cineole干預(yù)后可增強細胞活力、降低LDH含量、激活自噬和抑制細胞凋亡。給予自噬抑制劑CQ后，與Control組相比較，觀察到Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ和p62表達進一步增加，而CQ+HG+CH組與CQ+HG組比較時三者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明1,8-Cineole對HAECs自噬流的改善作用被CQ完全減弱，提示1,8-Cineole通過調(diào)節(jié)自噬流改善HG誘導(dǎo)自噬抑制；同時caspase-9和caspase-3較Control組明顯上調(diào)，而CQ+HG+CH組與CQ+HG組比較時二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明1,8-Cineole可能通過改善自噬流障礙來抑制細胞凋亡的發(fā)生，從而發(fā)揮其對高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷的保護作用。本文不足之處在于只在體外實驗中探討了抑制溶酶體后，檢測1,8-Cineole對Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ和p62表達和caspase-3和caspase-9蛋白表達情況，并未在體內(nèi)相對應(yīng)驗證1,8-Cineole的作用，從而闡明1,8-Cineole通過改善自噬流對糖尿病心血管疾病起到保護作用，未來的研究會對朝著這個方向深入研究，進一步深入系統(tǒng)闡明糖尿病血管內(nèi)皮損傷的關(guān)鍵機制與1,8-Cineole 的防治作用。

綜上所述，本研究提示1,8-Cineole對高糖誘導(dǎo)的人主動脈內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用，其調(diào)控機制可能與自噬流有關(guān)。