許剛柱， 丁志斌， 吳 濤

西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)外一科,陜西 西安 710003

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤(intracranial aneurysm，IA)在我國(guó)成人中患病率約為7%，大部分患者動(dòng)脈瘤直徑≤5 cm，動(dòng)脈瘤過(guò)大可引起動(dòng)脈瘤破裂，導(dǎo)致血液進(jìn)至蛛網(wǎng)膜下腔，誘發(fā)蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)，病死率較高[1]。IA破裂出血風(fēng)險(xiǎn)較高，預(yù)后普遍欠佳，是導(dǎo)致患者殘疾、病死的重要因素[2]。盡早評(píng)估患者病情，并預(yù)估動(dòng)脈瘤破裂風(fēng)險(xiǎn)是改善IA預(yù)后的關(guān)鍵，但現(xiàn)階段尚未尋求到理想指標(biāo)對(duì)動(dòng)脈瘤破裂風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。有研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)參與腫瘤、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、代謝等生物過(guò)程，并且對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)功能有調(diào)節(jié)作用[3]。而VSMC具備表型轉(zhuǎn)化功能，能調(diào)節(jié)血管張力、血流大小，一旦血管環(huán)境出現(xiàn)異常，VSMC會(huì)產(chǎn)生炎癥，促進(jìn)血管粥樣硬化，參與IA進(jìn)展[4]。miR-145-5p是重要的VSMC調(diào)節(jié)因子，miR-145-5p過(guò)表達(dá)對(duì)這類細(xì)胞分化有促進(jìn)作用[5]。外泌體是血清或血漿內(nèi)miRNA的主要聚集地，其自身攜帶較多的生物分子，能傳遞細(xì)胞與細(xì)胞之間的信息，通過(guò)測(cè)定外泌體內(nèi)miRNA表達(dá)量，能更有效提升疾病診斷準(zhǔn)確度[6]。本研究旨在探討血漿外泌體miR-145-5p在IA患者中的表達(dá)量，并分析其與動(dòng)脈瘤破裂的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2018年9月至2020年9月收治的110例IA患者納入IA組，選取同期于我院體檢的92例健康體檢者納入健康組。根據(jù)IA破裂情況[7]將IA組分成破裂組(n=32)與未破裂組(n=78)。健康組男性50例，女性42例；平均年齡(57.02±9.94)歲；體質(zhì)量指數(shù)(22.97±2.86)kg/m2；吸煙史9例，飲酒史12例。IA組男性56例，女性54例；平均年齡(59.62±8.63)歲；體質(zhì)量指數(shù)(23.19±2.04)kg/m2；吸煙史16例，飲酒史18例。兩組的性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) IA組納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)全腦血管造影或CT等證實(shí)為IA；首次發(fā)?。痪駹顟B(tài)、認(rèn)知功能正常。健康組納入標(biāo)準(zhǔn)：身體健康狀態(tài)良好；年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)等基線資料與IA組匹配；精神狀態(tài)、認(rèn)知功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：顱內(nèi)血腫、腦實(shí)質(zhì)出血者；因非顱內(nèi)動(dòng)脈瘤因素(如血管畸形)所致的SAH者；凝血功能與肝、腎、心、肺功能嚴(yán)重受損者；既往有顱腦手術(shù)史者；夾層動(dòng)脈瘤、感染性動(dòng)脈瘤等繼發(fā)性動(dòng)脈瘤者；惡性腫瘤者；自身免疫性疾病者；血液疾病、重度感染者。

1.3 研究方法 主要儀器為T(mén)G16KR離心機(jī)(上海繼譜電子科技有限公司)、低溫冰箱(北京亞星儀科公司)、熒光定量?jī)x(德國(guó)耶拿公司)、透射電鏡(德國(guó)耶拿公司)。主要試劑為甘氨酸緩沖液(南京森貝伽生物公司)、無(wú)水乙醇(金沂蒙集團(tuán))、氯仿(金沂蒙集團(tuán))、miR-145-5p檢測(cè)試劑(上海冠泰生物科技有限公司)。兩組分別在體檢或確診當(dāng)日進(jìn)行檢測(cè)，采集肘靜脈血4 ml，將血樣抗凝處理，分離血漿，離心后，獲取血漿樣本，存放于-70℃冰箱待測(cè)。提取外泌體：血漿解凍，4℃下離心10 min；取700 μl上清液加入700 μl緩沖液，顛倒混合5次后離心1 min，棄濾出液；將離心柱置于收集管；加入洗滌液3.5 ml，離心5 min，棄濾出液，將離心柱置于新收集管，提取外泌體。外泌體鑒定：取10～20 μl無(wú)菌去離子水放置在離心柱中，針對(duì)外泌體進(jìn)行吹打重懸，置于EP管內(nèi)，對(duì)外泌體微粒懸液進(jìn)行制備，吹打混合；取外泌體懸液10 μl，滴于紙上，經(jīng)電鏡銅網(wǎng)狀柵將其覆蓋，時(shí)間1 min，負(fù)染15 s，在室溫下風(fēng)干，經(jīng)透射電子顯微鏡對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定。提取血漿外泌體miRNA：將離心柱置于新收集管內(nèi)，取QIAzol液加入，在室溫下離心5 min，取濾液移至新EP管，充分混合，在室溫下反應(yīng)5 min，溶解核蛋白復(fù)合物；取氯仿90 μl置于EP管，振蕩15 s，在室溫下反應(yīng)3 min，離心15 min；取上層液300 μl置于新EP管，取乙醇700 μl加入，混合離心后，棄濾液；取緩沖液離心后棄濾液，操作3次后取離心柱置于2 ml新收集管，離心5 min，棄收集管；將離心柱置于新EP管，取RNase-free水14 μl置于離心柱膜，將蓋子蓋緊，在室溫下反應(yīng)1 min，離心1 min，棄離心柱，獲取RNA。通過(guò)生物科技公司對(duì)miRNA行測(cè)序分析，然后經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s；變性95℃ 5 s、退火60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。miR-145-5p序列為5’-CAGTTTTCCCAGGAATCCCTAA-3’。待反應(yīng)完畢，經(jīng)2-△△Ct表示血漿外泌體miR-145-5p的相對(duì)表達(dá)量?；颊呷朐汉螅ㄟ^(guò)查閱病歷、詢問(wèn)既往史、體格檢查等方式，收集其臨床資料，包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、飲酒史、糖尿病、高血壓、高脂血癥、動(dòng)脈瘤大小、動(dòng)脈瘤部位、是否多發(fā)以及血漿外泌體miR-145-5p表達(dá)量。利用多因素Logistic回歸模型分析患者動(dòng)脈瘤破裂的危險(xiǎn)因素。

2 結(jié)果

2.1 IA組、健康組血漿外泌體miR-145-5p表達(dá)水平比較 IA組的血漿外泌體miR-145-5p表達(dá)量為(11.63±3.06)，顯著高于健康組的(5.32±1.19)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 破裂組與未破裂組臨床資料分析 兩組患者的年齡、血漿外泌體miR-145-5p表達(dá)量以及糖尿病、高脂血癥、動(dòng)脈瘤直徑≥5 cm患者比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 破裂組、未破裂組的臨床資料分析/例(百分率/%)

2.3 IA患者動(dòng)脈瘤破裂多因素分析 采用多因素Logistic回歸分析對(duì)IA患者動(dòng)脈瘤破裂的影響因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，年齡≥60歲、糖尿病、高脂血癥、動(dòng)脈瘤直徑≥5 cm、血漿外泌體miR-145-5p表達(dá)量≥11.63是IA患者動(dòng)脈瘤破裂的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 IA患者動(dòng)脈瘤破裂危險(xiǎn)因素分析

2.4 血漿外泌體miR-145-5p表達(dá)量對(duì)IA患者動(dòng)脈瘤破裂評(píng)估價(jià)值 血漿外泌體miR-145-5p表達(dá)量評(píng)估IA患者動(dòng)脈瘤破裂的曲線下面積為0.765，最佳界值為10.145，敏感度為80.80%，特異度為81.20%，見(jiàn)圖1。

圖1 血漿外泌體miR-145-5p表達(dá)量評(píng)估IA患者動(dòng)脈瘤破裂的ROC曲線

3 討論

IA是常見(jiàn)的腦血管疾病，3.6%～6.0%的患者出現(xiàn)隱匿性動(dòng)脈瘤破裂，一旦發(fā)生破裂出血，則會(huì)增加致殘率、病死率[8]。盡早明確IA患者動(dòng)脈瘤破裂風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)動(dòng)脈瘤破裂進(jìn)行預(yù)測(cè)，有利于改善預(yù)后。循環(huán)血內(nèi)miRNA表達(dá)對(duì)IA及腦出血的評(píng)估有一定價(jià)值，且外周血miRNA易儲(chǔ)存、穩(wěn)定性好，通過(guò)測(cè)定外周血miRNA表達(dá)，有利于進(jìn)一步了解IA病情進(jìn)展情況[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中含有miRNA，且外泌體內(nèi)miRNA的抗降解能力更好，對(duì)評(píng)估病情進(jìn)展更有利[10]。鑒于此，臨床可以考慮測(cè)定血漿外泌體內(nèi)miRNA表達(dá)量，分析IA進(jìn)展情況。氧化應(yīng)激在IA發(fā)病、進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可引起內(nèi)皮功能紊亂，促進(jìn)VSMC增生，削弱氧自由基清除能力，促進(jìn)IA進(jìn)展[11]。有研究表明，miR-145-5p對(duì)氧化應(yīng)激有調(diào)控作用，但具體作用機(jī)制尚不明確[12]。據(jù)此推測(cè)，臨床通過(guò)分析IA患者的血漿外泌體miR-145-5p表達(dá)量，可能為IA進(jìn)展評(píng)估提供依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，與健康體檢者相比，血漿外泌體miR-145-5p表達(dá)量明顯增高。miR-145-5p檢測(cè)既往在腫瘤疾病研究中有所應(yīng)用，袁亞男等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-145-5p可通過(guò)調(diào)控多藥耐藥基因蛋白，影響結(jié)腸癌的耐藥性。于潛等[14]研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌患者的癌組織內(nèi)miR-145-5p表達(dá)水平下調(diào)。此外，miR-145-5p與VSMC分化密切相關(guān)，其能調(diào)節(jié)VSMC表型以及增殖、遷移[15]。研究表明，miR-145-5p高表達(dá)可促使VSMC分化能力提升，一旦其表達(dá)水平下調(diào)，則會(huì)導(dǎo)致VSMC分化受到抑制，其表達(dá)量的變化最終可誘發(fā)血管新內(nèi)膜損害[16]。而VSMC增殖及凋亡失衡是導(dǎo)致IA發(fā)生、進(jìn)展的重要因素[17]。由此可見(jiàn)，miR-145-5p可能通過(guò)調(diào)節(jié)VSMC參與IA發(fā)病與進(jìn)展。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IA患者動(dòng)脈瘤破裂主要與年齡、糖尿病、高脂血癥、動(dòng)脈瘤直徑以及血漿外泌體miR-145-5p表達(dá)量有關(guān)。分析原因如下：(1)年齡≥60歲的患者動(dòng)脈壁順應(yīng)性明顯減弱，彈力也相應(yīng)削弱，容易出現(xiàn)動(dòng)脈血管硬化，促進(jìn)動(dòng)脈瘤破裂[18]；(2)糖尿病的主要特點(diǎn)為慢性高血糖，長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)可導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，促使血清低密度脂蛋白、甘油三酯表達(dá)上調(diào)，而高密度脂蛋白含量下降，為單核細(xì)胞到達(dá)內(nèi)膜提供條件，增加動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)，致動(dòng)脈瘤形成風(fēng)險(xiǎn)增高[19]；(3)高脂血癥可導(dǎo)致血管壁細(xì)胞退化，或引起炎癥，損害瘤壁內(nèi)皮，破壞顱內(nèi)血管完整性，增加動(dòng)脈瘤破裂風(fēng)險(xiǎn)[20]；(4)動(dòng)脈瘤直徑越大，瘤內(nèi)所承擔(dān)的壓力也越大，更容易出現(xiàn)動(dòng)脈瘤破裂[21]；(5)血漿外泌體miR-145-5p的過(guò)表達(dá)可能導(dǎo)致VSMC的增殖與凋亡失衡，引起血管新內(nèi)膜損害[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈瘤數(shù)量也與動(dòng)脈瘤破裂發(fā)生有關(guān)，多發(fā)性IA患者更易發(fā)生破裂出血[23]。而本研究并未體現(xiàn)這點(diǎn)，筆者認(rèn)為原因可能在于樣本量較小，未來(lái)還需增加樣本量對(duì)此予以探討。本研究通過(guò)繪制ROC曲線，證實(shí)血漿外泌體miR-145-5p表達(dá)量對(duì)動(dòng)脈瘤破裂的評(píng)估有一定價(jià)值，曲線下面積高達(dá)0.765。miR-145-5p是調(diào)節(jié)VSMC表型的重要因子，臨床可以考慮將下調(diào)血漿外泌體miR-145-5p表達(dá)水平作為治療IA的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，年齡≥60歲、糖尿病、高脂血癥、動(dòng)脈瘤直徑≥5 cm、血漿外泌體miR-145-5p表達(dá)量≥11.63是IA患者動(dòng)脈瘤破裂的危險(xiǎn)因素。miR-145-5p在IA患者血漿外泌體中呈過(guò)表達(dá)，且其對(duì)動(dòng)脈瘤破裂風(fēng)險(xiǎn)存在一定評(píng)估價(jià)值，臨床可考慮將該指標(biāo)作為日后IA診療的依據(jù)之一。