穆軍山， 崔曉萍， 周 賀， 王魁花， 葉建新

解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，福建 福州 350025

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種黑質(zhì)紋狀體區(qū)多巴胺神經(jīng)元細胞丟失而導致多巴胺生成障礙及Lewy小體形成為主要病理特征的進行性變性疾病[1]。PD患者的典型癥狀為靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢平衡障礙等[2-5]。目前，臨床上治療PD主要通過神經(jīng)保護、手術和康復運動等方法，但效果均難以令人滿意[6-7]。Lewy小體為含α突觸核蛋白(α-Synuclein，α-Syn)和泛素的蛋白包涵體。其中，α-Syn是由140個氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)，正常生理狀況下呈無序結構，但PD患者的α-Syn發(fā)生突變，導致α螺旋結構被破壞，形成β折疊，從而聚集并產(chǎn)生具有神經(jīng)毒性作用的纖維絲樣蛋白聚集體[8]。有研究顯示，α-Syn等異常蛋白的大量聚集和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)的功能障礙是導致PD患者神經(jīng)退行性病變的主要因素[9]。miRNA是一類小分子非編碼RNA，其可通過調(diào)控基因表達參于細胞的增殖、分化、凋亡及自噬等多個生命活動，并在炎性疾病、癌癥及免疫性疾病等多種疾病的發(fā)病、診斷和治療中發(fā)揮不同作用[10-14]。PD患者存在多種miRNA表達量異常[15]。有研究表明，miR-26a在小鼠PD的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[16]。但目前，關于miR-26與PD相關的研究尚未見明確定論。因此，本研究擬通過建立PD小鼠模型，探討miR-26和α-Syn表達情況及二者的相關性，并分析miR-26對UPS的影響，旨在闡述miR-26在PD發(fā)病和進展中可能的分子機制，以期為PD的診斷和治療提供新的思路?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 成年雄性C57BL/6小鼠120只，體質(zhì)量25～30 g，分籠飼養(yǎng)。所有小鼠均購自中科院動物研究所。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)、MG132均購自國藥集團；Neurobasal培養(yǎng)基、D-hanks液均購自美國Gibco公司；TRIzol reagent、反轉錄試劑盒和SYBR GREEN均購自日本TOYOBO公司；miR-26模擬物(miR-26 mimic)、miR-26 抑制物(miR-26 inhibitor)、Lipo 2000轉染試劑盒、加尾法miRNA cDNA第1鏈合成試劑盒和miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒均購自美國Sigma-Aldrich公司；抗α-Syn抗體和兔抗人抗體均購自英國Abcam公司。SH-SY5Y細胞購自北納生物。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉染 將SH-SY5Y細胞接種至6孔板中，加入2 ml RPMI 1640培養(yǎng)基及青霉素、鏈霉素，于含5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞密度約60%且狀態(tài)良好時，更換新鮮培養(yǎng)基，用無菌磷酸鹽緩沖液配制1-甲基-4-苯基-吡啶離子(1-methyl-4-phenyl-pyridine ion，MPP+)溶液，調(diào)至濃度為1 mmol/L后，加入到細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，建立PD細胞模型。培養(yǎng)24 h后，加入到細胞中，分別轉染miR-26 mimic、miR-26 inhibitor或加入MG132。培養(yǎng)6 h后，更換新鮮的培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收獲細胞備用。

1.3 PD病小鼠模型的建立 將120只小鼠隨機分為對照組和模型組，每組各60只。模型組小鼠腹腔注射MPTT溶液20 mg/kg，每日1次；對照組小鼠腹腔注射無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)20 mg/kg，每日1次。所有小鼠在連續(xù)注射后5 d后處死，提取中腦黑質(zhì)區(qū)組織備用。

1.4 反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應檢測α-Syn mRNA的表達水平 模型組和對照組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)組織用液氮研磨制成單細胞懸液。將SH-SY5Y細胞及兩組小鼠腦黑質(zhì)區(qū)組織研磨成的單細胞懸液分別用Trizol法抽提總RNA，分光光度法進行定量，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。用反轉錄試劑盒獲得cDNA，根據(jù)SYBR GREEN試劑盒進行反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測。其中，miR-26的RNA提取用小RNA提取試劑盒；cDNA的獲得用加尾法miRNA cDNA第1鏈合成試劑盒；檢測用miRNA熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測試劑盒。用2(-ΔΔct)法分析數(shù)據(jù)。引物設計由上海英駿生物技術有限公司合成。見表1。

表1 RT-PCR引物信息表

1.5 蛋白免疫印跡法檢測蛋白酶體的表達 收獲SH-SY5Y細胞，用SDS loading buffer處理蛋白樣品后進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后轉至PVDF膜，5%牛血白蛋白(bovine serum albumin，BSA)于4℃封閉過夜，洗滌后37℃敷一抗(抗α-Syn抗體)1 h，再洗滌3次，于37℃敷二抗(兔抗人抗體)30 min，洗滌后顯影。

2 結果

2.1 PD小鼠模型中miR-26上調(diào)并與α-Syn呈正相關 RT-PCR檢測結果顯示，模型組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)組織中miR-26、α-Syn水平均顯著高于對照組，兩組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。模型組小鼠腦黑質(zhì)區(qū)組織中miR-26水平與α-Syn的mRNA水平呈正相關(r=0.762 2，P<0.05)。這表明，在PD小鼠模型中，miR-26和α-Syn的表達均上調(diào)，且二者的水平呈正相關，即miR-26可能促進α-Syn的表達。見圖2。

圖1 RT-PCR檢測PD小鼠模型腦黑質(zhì)區(qū)組織中miR-26、α-Syn的表達情況(a.miR-26；b.α-Syn) 圖2 PD小鼠模型腦黑質(zhì)區(qū)組織中miR-26、α-Syn表達的相關性

2.2 PD病細胞模型中miR-26抑制UPS對α-Syn的降解 蛋白免疫印跡法和RT-PCR檢測結果顯示，SH-SY5Y細胞在轉染miR-26 mimic后，α-Syn的蛋白水平升高；轉染miR-26 inhibitor后，α-Syn的蛋白水平降低；而轉染miR-26 mimic或miR-26 inhibitor后，α-Syn的mRNA水平均無顯著變化；加入MG132后，α-Syn蛋白水平升高，α-Syn的mRNA水平無顯著變化。這表明，miR-26不直接調(diào)節(jié)α-Syn的mRNA或蛋白表達水平，而是起到與MG132類似的作用。即抑制UPS對α-Syn的降解。見圖3～4。

圖3 RT-PCR檢測PD小鼠模型腦黑質(zhì)區(qū)組織中miR-26、α-Syn的mRNA水平(a.miR-26；b.α-Syn) 圖4 蛋白免疫印跡法檢測PD小鼠模型腦黑質(zhì)區(qū)組織中α-Syn的蛋白水平

3 討論

PD是一種嚴重影響老年人身心健康和生活質(zhì)量的疾病[17]。其典型的病理改變是多巴胺生成障礙及Lewy小體形成，其中，Lewy小體的主要成分是α-Syn，PD患者的α-Syn發(fā)生突變，可對多巴胺能神經(jīng)元有選擇性神經(jīng)毒性作用[18]。本研究通過建立PD小鼠模型，檢測模型小鼠中腦黑質(zhì)部分中miR-26和α-Syn的水平。結果發(fā)現(xiàn)，模型小鼠中miR-26和α-Syn的水平均顯著高于對照組小鼠，且二者的水平呈正相關。這表明，miR-26可能通過某種方式促進α-Syn的表達，因此，需要通過進一步的細胞實驗予以驗證。PD的動物模型主要有兩大類，分別是通過神經(jīng)毒素誘導多巴胺能神經(jīng)元變性和模擬PD神經(jīng)遞質(zhì)缺失[19]。本研究選取MPTP建立小鼠模型屬于第一類，效果穩(wěn)定，模型動物的癥狀和病理改變亦比較接近人類，結果比較可靠。

本研究通過MPP+法獲得PD細胞模型，并通過轉染miR-26模擬物或miR-26抑制物以驗證miR-26是否能直接調(diào)控α-Syn的表達。結果顯示，轉染miR-26 mimic或miR-26 inhibitor后，細胞中α-Syn的mRNA表達無顯著變化。這表明，miR-26并不能在mRNA水平上直接調(diào)控α-Syn的表達。而轉染miR-26 mimic后，α-Syn的蛋白水平增加，轉染miR-26 inhibitor后α-Syn的蛋白水平降低，這種效果與UPS的抑制劑MG132完全相同。MG132是UPS的抑制物，只能抑制UPS對α-Syn蛋白的降解，不能影響α-Syn的mRNA水平[20]。這表明，miR-26可能起到與MG132類似的作用，抑制UPS對α-Syn蛋白的降解，其可能與UPS中的某個蛋白具有相關性，可能通過調(diào)節(jié)該蛋白以抑制UPS的功能。有研究顯示，TWIST1/miR-199/214可促進UPS的活性上調(diào)[21]，miR-7可調(diào)節(jié)細胞自噬并促進UPS的功能[22]。這與本研究有相符之處。

綜上所述，miR-26水平在PD小鼠模型中上調(diào)，并與α-Syn的水平呈正相關，在PD細胞模型中發(fā)現(xiàn)miR-26并不能直接調(diào)節(jié)α-Syn的mRNA的表達水平，僅能抑制UPS對α-Syn蛋白的降解。今后，可通過不同的動物模型和細胞模型以及PD患者的臨床標本以驗證該結論，并通過分子生物學實驗確定miR-26的靶蛋白，進一步研究miR-26抑制UPS功能的分子機制，以期闡明miR-26在PD中的作用，為PD發(fā)病機制的研究提供新的方向。