陳 勇， 鄧 美， 鄒 飛， 彭 拓， 傅 饒， 張 洋

重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院 泌尿外科，重慶 404100

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是腎常見的腫瘤之一，約占所有成人惡性腫瘤的3%[1]。約有1/3的RCC患者在診斷時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，且對放化療不敏感，預(yù)后較差[2]。深入分析RCC的生物學(xué)標(biāo)志物并尋找潛在治療靶點(diǎn)，對早期診治并改善生存預(yù)后有重要價值。miRNA與細(xì)胞增殖、分化、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為密切相關(guān)，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用[3-4]。miRNA對腫瘤的早期診斷、治療和預(yù)后評價有一定價值[4]。miRNA-592在多種癌癥中異常表達(dá)，如miRNA-592在肝癌組織中低表達(dá)，可能通過靶向DEK基因抑制肝癌細(xì)胞的增殖[5]；在膠質(zhì)瘤組織中低表達(dá)，通過靶向IGFBP2抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖與侵襲，促進(jìn)凋亡[6]。但也有研究表明，miRNA-592在結(jié)直腸癌細(xì)胞中高表達(dá)，抑制其表達(dá)可降低癌細(xì)胞的增殖和遷移[7]。本研究檢測RCC組織和細(xì)胞中miRNA-592的表達(dá)，通過沉默miRNA-592觀察細(xì)胞增殖與凋亡的變化，并分析miRNA-592與RCC預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于上海復(fù)祥生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒與2×SYBR Green PCR Mastermix試劑盒購于美國Sigma公司，引物均由廣州伯信生物科技有限公司設(shè)計并提供，BCA蛋白定量試劑盒和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)快速制備試劑盒購于上海語純生物科技有限公司，CCK-8試劑盒和凋亡檢測試劑盒購于上海語純生物科技有限公司，Cyclin B1、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和GAPDH內(nèi)參抗體購于美國Sigma公司，Bax和Cleaved caspase-3抗體購于英國Abcam公司。正常人腎上皮細(xì)胞系(HK-2)和人RCC細(xì)胞系(786-O、ACHN、Caki-1和769-P)購于中科院上海細(xì)胞庫。在含10%胎牛血清、鏈霉素100 μg/ml及青霉素100 U/ml的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時進(jìn)行傳代。

1.1.2 組織樣本 選取2011年2月至2012年12月重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除的110例RCC患者的RCC組織及其配對的癌旁組織(距離癌組織≥5 cm)，患者術(shù)前均未接受放療、化療或免疫治療?；颊呔炇鹬橥鈺?。

1.2 研究方法

1.2.1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測組織和細(xì)胞中miRNA-592的表達(dá)水平 用TRIzol法提取組織和細(xì)胞中的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，隨后用熒光定量試劑盒進(jìn)行檢測，反應(yīng)條件：加熱95℃，時間30 min，變性94℃ 15 s，退火55℃ 30 s，延伸70℃ 30 s，共40個循環(huán)。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，用2-△△Ct法計算miRNA-592相對表達(dá)量。引物序列：miRNA-592上游-3′-CGAGCTGAGTGCGTCCTGTC-5′；下游5′-TCGCTGGCCGTGAGTCTGT-5′；U6上游5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′；下游5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。

1.2.2 轉(zhuǎn)染 用LipofectAMINETM 2000試劑盒將miRNA-592沉默質(zhì)粒(sh-miRNA-592組)或空載體質(zhì)粒(sh-NC組)轉(zhuǎn)染入轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞。首先制備LipofectAMINETM 2000復(fù)合物和DNA復(fù)合物，DNA復(fù)合物包括4 μg濃度為1 μg/μl的質(zhì)粒與246 μl的無血清培養(yǎng)基。隨后將兩種復(fù)合物混勻，溫室靜置15 min。將混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)板，溫室孵育6 h后更換含血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn) 用胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后的786-O細(xì)胞，將其接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，培養(yǎng)3周。出現(xiàn)菌落時停止培養(yǎng)，用4 %多聚甲醛固定并進(jìn)行結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計算克隆細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 CCK-8法檢測786-O細(xì)胞增殖能力 用CCK-8試劑盒檢測786-O細(xì)胞活性，細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96 h時，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處讀取吸光度，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 Annexin-V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測786-O細(xì)胞凋亡情況 轉(zhuǎn)染后取對數(shù)生長期細(xì)胞，用500 μl預(yù)冷1倍結(jié)合緩沖液將786-O細(xì)胞制成1×106個/ml的懸液。加入5 μl異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)，混勻后37℃、5%CO2培養(yǎng)10 min；隨后加入2.5 μl碘化丙啶(propidium iodide，PI)，孵育5 min。最后用流式細(xì)胞儀檢測786-O細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 免疫印跡法檢測786-O細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白 首先用RAPI裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白，包括細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白(Cyclin B1、PCNA)和凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Cleaved caspase-3)。用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，10%SDS-PAGE分離蛋白，半干轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。隨后用5 %脫脂奶粉封閉2 h，加入Cyclin B1(1∶1 000)、PCNA(1∶500)、Bax(1∶500)、Cleaved caspase-3(1∶500)抗體4℃過夜孵育，第2天用TBST緩沖液洗滌3次后加入二抗，封閉1 h。ECL發(fā)光儀進(jìn)行蛋白成像，Image J軟件分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-592在RCC組織和細(xì)胞中的表達(dá) 癌組織中miRNA-592相對表達(dá)量為(2.34±0.47)，明顯高于癌旁組織的(0.97±0.41)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HK-2細(xì)胞的miRNA-592相對表達(dá)量為(1.01±0.08)，低于786-O細(xì)胞(3.84±0.47)、ACHN細(xì)胞(2.76±0.53)、Caki-1細(xì)胞(1.98±0.12)和769-P細(xì)胞(2.45±0.52)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 miRNA-592與RCC臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系 以miRNA-592表達(dá)中位數(shù)為截斷值，將110例RCC患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，每組55例。兩組的T分期患者比例比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組的年齡、腫瘤位置、組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。110例RCC患者中位隨訪時間為50.6個月，隨訪期內(nèi)32例患者因各種原因死亡。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，miRNA-592高表達(dá)患者的存活率低于低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

表1 miRNA-592低表達(dá)組、高表達(dá)組的臨床病理特征比較/例(百分率/%)

圖1 miRNA-592高表達(dá)、低表達(dá)組患者生存曲線

2.3 沉默miRNA-592對786-O細(xì)胞增殖和凋亡的影響 sh-miRNA-592組miRNA-592相對表達(dá)量為(1.01±0.12)，低于sh-NC組的(3.14±0.23)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。sh-miRNA-592組細(xì)胞培養(yǎng)48、72和96 h時細(xì)胞增殖檢測光密度值均低于sh-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。sh-miRNA-592組細(xì)胞克隆數(shù)為(51.13±15.03)個，低于sh-NC組的(100.45±38.16)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。sh-miRNA-592組細(xì)胞凋亡率為(16.59%±4.01%)，高于sh-NC組的(5.99%±1.30%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2～4。

圖2 sh-miRNA-592組細(xì)胞培養(yǎng)48、72和96 h時細(xì)胞增殖光密度值

圖3 菌落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

圖4 Annexin-V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡(a.sh-NC組；b.sh-miRNA-592組)

2.4 沉默miRNA-592對786-O細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的影響 sh-miRNA-592組Cyclin B1和PCNA蛋白相對表達(dá)量分別為(0.46±0.08)和(0.44±0.06)，均低于sh-NC組的(0.89±0.11)和(1.13±0.16)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。sh-miRNA-592組Bax和Cleaved caspase-3蛋白相對表達(dá)量分別為(0.87±0.07)和(1.22±0.12)，均高于sh-NC組的(0.49±0.10)和(0.38±0.07)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 沉默miRNA-592對786-O細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的影響

3 討論

有研究表明，miRNA在癌癥中異常表達(dá)，并且與疾病進(jìn)展和生存預(yù)后有關(guān)[8-10]。在RCC中，許多miRNA已被證實(shí)與生存預(yù)后有關(guān)，例如miRNA-935、miRNA-21和miRNA-200等[11-13]。miRNA-592是近年來發(fā)現(xiàn)的新分子，被證實(shí)和肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌和甲狀腺癌有關(guān)[7，14-15]。本研究旨在分析miRNA-592在RCC中的表達(dá)及其與生存預(yù)后的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，RCC癌組織中miRNA-592相對表達(dá)量高于癌旁組織，人RCC細(xì)胞系(786-O、ACHN、Caki-1和769-P)miRNA-592相對表達(dá)量均高于正常人腎上皮細(xì)胞系(HK-2)，提示miRNA-592可能是RCC的癌基因。但也有研究表明，miRNA-592在肝細(xì)胞癌、膠質(zhì)瘤和甲狀腺癌中低表達(dá)，可能是抑癌基因[5,15]，說明miRNA-592的表達(dá)可能有組織特異性。

本研究結(jié)果顯示，miRNA-592與RCC的T分期有關(guān)，說明miRNA-592可能參與RCC的進(jìn)展。miRNA-592的生物學(xué)機(jī)制目前尚未明確，可能通過靶向調(diào)控IGF-1R、DEK、LHCGR和NOVA1等基因，參與細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡與周期性死亡，進(jìn)而參與疾病的發(fā)生、發(fā)展[5，14-16]。 細(xì)胞增殖和凋亡是影響癌癥進(jìn)展的重要生物學(xué)機(jī)制。既往研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-592與癌細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)[6,14]。本研究采用LipofectAMINETM 2000試劑盒將miRNA-592沉默質(zhì)粒(sh-miRNA-592組)或空載體質(zhì)粒(sh-NC組)轉(zhuǎn)染入轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞，結(jié)果顯示，沉默miRNA-592后786-O細(xì)胞的增殖活力及相關(guān)增殖蛋白表達(dá)均受到抑制，而凋亡及相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)明顯增高，以上說明miRNA-592可能參與RCC進(jìn)展。本研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA-592與RCC生存預(yù)后有關(guān)，miRNA-592高表達(dá)患者的存活率低于低表達(dá)患者。

綜上所述，miRNA-592在RCC中的高表達(dá)與不良生存預(yù)后有關(guān)，沉默miRNA-592可抑制RCC細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡。本研究存在一些局限性，例如未檢測RCC患者外周血miRNA-592的表達(dá)，未檢測miRNA-592下游靶分子的變化。miRNA-592可能會成為RCC的分子生物學(xué)標(biāo)志物，未來需要深入探討其作用機(jī)制。