杜鵬舉， 潘春勤， 劉 杰， 郭 琴

長(zhǎng)江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院 腎病內(nèi)科，湖北 仙桃 433000

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是終末期腎病較常見的病因[1]。臨床上以出現(xiàn)腎小球?yàn)V過(guò)率(glomerular filtration rate，GFR)顯著下降作為其診斷的直接指標(biāo)[2]。目前，對(duì)于DN的早期識(shí)別，仍缺乏有效的標(biāo)志物。高遷移率族B1蛋白(high-mobility group box-1 protein，HMGB1)是一種高度保守的核DNA結(jié)合蛋白，可以主動(dòng)或被動(dòng)釋放至細(xì)胞外，成為促炎細(xì)胞因子或組織損傷的報(bào)警信號(hào)[3]。此外，Chen等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-129表達(dá)降低可能是HMGB1炎性信號(hào)軸激活的重要原因。人類體液中含有大量外泌體，外泌體中含有的miRNAs表達(dá)穩(wěn)定，且重復(fù)性和一致性良好，可作為不同條件下的敏感生物標(biāo)志物[5]。因此，本研究旨在探討早期DN患者尿外泌體miR-129、尿HMGB1表達(dá)水平，分析其在DN早期診斷中的臨床價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2018年7月至2019年12月長(zhǎng)江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院收治的168例2型糖尿病患者作為研究對(duì)象，根據(jù)Mogensen分期[6]將無(wú)糖尿病相關(guān)血管并發(fā)癥的受試者納入單純糖尿病組(n=93)，早期DN患者納入早期DN組(n=75)，另選取50例血常規(guī)、肝腎功能指標(biāo)檢測(cè)正常的健康者納入非糖尿病組。本研究中，所有糖尿病患者均符合美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。單純糖尿病組：男性58例，女性35例；年齡38～77歲，平均年齡(56.71±12.91)歲。早期DN組：男性46例，女性29例；年齡40～78歲，平均年齡(60.80±12.77)歲；尿白蛋白/肌酐比值(urine albumin/creatinine ratio，UALB/Cr)30～299 mg/g，至少連續(xù)檢測(cè)2次，出現(xiàn)微量白蛋白尿(早期，尿白蛋白排泄率20～200 μg/min)。非糖尿病組男性30例，女性20例；年齡35～79歲，平均年齡(58.52±14.85)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)自身免疫性、傳染性、血液、惡性、器質(zhì)性或炎癥性疾??；(2)病態(tài)肥胖(體質(zhì)量指數(shù)≥40 kg/m2)；(3)心血管病史(包括缺血性心臟病、外周血管疾病、腦梗死，以及與心血管風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的慢性疾病)；(4)嚴(yán)重感染；(5)糖尿病神經(jīng)病變者。3組患者在性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有受試者均簽署知情同意書。

表1 3組受試者的臨床資料比較

1.2 研究方法

1.2.1 尿液采集和外泌體提取鑒定 入組次日上午(8∶00～10∶00)，每個(gè)受試者收集大約13 ml尿液，-80℃凍存?zhèn)溆?。尿液?℃，2 000 r/min離心15 min，以清除細(xì)胞碎片。加入Exo快速外顯體沉淀試劑(美國(guó)System Biosciences公司)于10 000 r/min再次離心15 min。然后用0.22 μm濾膜過(guò)濾上清液，凍存12 h，10 000 r/min超速離心30 min得到外泌體顆粒，重懸于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中。應(yīng)用透射電鏡觀察外泌體顆粒形態(tài)，納米粒徑跟蹤分析顆粒大小分布，蛋白免疫印跡法檢測(cè)標(biāo)志蛋白分子TSG101和CD63的表達(dá)。

1.2.2 尿外泌體miR-129水平檢測(cè) 采用Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)提取總RNA，再由反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)。基因擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火25 s，74℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法以U6為內(nèi)參計(jì)算miR-129的相對(duì)表達(dá)量。miR-129的正向引物為5′-TCG CGA ATC TTT TTG CGG TCT-3′，反向引物為5′-GCT TTT TGG GGT AAG GGC TTC-3′；U6正向引物為5′-GAC GAA TAC CGG CGT GAG AA-3′，反向引物為5′-AAA TTC TGT TTG CGG TGC GT-3′。

1.2.3 尿HMGB1水平檢測(cè) 采用人HMGB1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immuno-sorbent assay，ELISA)試劑盒(美國(guó)ProteinTech公司)檢測(cè)尿HMGB1水平。在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(optical density，OD)值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算相應(yīng)濃度。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因分析 經(jīng)TargetScan(www.targetscan.org/vert_72/)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示HMGB1 mRNA可能含有2個(gè)與miR-129結(jié)合的靶向位點(diǎn)。因此，化學(xué)合成了2對(duì)HMGB1的3’UTR序列，其中包含野生型或突變型 miR-129結(jié)合位點(diǎn)，并克隆到pmirGLO雙熒光素酶miRNA靶表達(dá)載體的下游。重組載體分別命名為 pmirGLO-HMGB1-WT1、pmirGLO-HMGB1-WT2、pmirGLO-HMGB1-MUT1和pmirGLO-HMGB1-MUT2。通過(guò)測(cè)序證實(shí)了插入和突變。將HUVECs細(xì)胞與熒光素酶報(bào)告載體和miR-129模擬物(miR-129 mimics)或陰性對(duì)照(miR-NC)共轉(zhuǎn)染，檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 尿液外泌體形態(tài)學(xué)和生化特征 細(xì)胞外囊泡經(jīng)透射電鏡觀察、納米粒徑跟蹤技術(shù)分析和蛋白免疫印跡法檢測(cè)，以確認(rèn)其性質(zhì)。結(jié)果表明，回收的囊狀小泡為球形結(jié)構(gòu)，多數(shù)粒子直徑在50～150 nm，蛋白免疫印跡法檢測(cè)標(biāo)記分子，出現(xiàn)CD63和TSG101特異性條帶。見圖1。

圖1 尿液外泌體形態(tài)學(xué)和生化特征[a.通過(guò)透射電子顯微鏡鑒定外泌體(用白色箭頭表示)；b.蛋白免疫印跡法檢測(cè)TSG101蛋白和CD63蛋白；c.各組尿液樣本中外泌體粒徑分布]

2.2 3組受試者尿外泌體miR-129、尿HMGB1水平以及血糖、腎功能比較 單純糖尿病組和早期DN組患者尿外泌體miR-129表達(dá)均低于非糖尿病組、尿HMGB1水平和空腹血糖水平均高于非糖尿病組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而單純糖尿病組患者尿外泌體miR-129表達(dá)和估算的腎小球?yàn)V過(guò)率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)值均高于早期DN組，尿HMGB1水平、空腹血糖和UALB/Cr比值均低于早期DN組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而非糖尿病組和單純糖尿病組患者UALB/Cr比值、eGFR值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組受試者尿外泌體miR-129、尿HMGB1水平以及血糖、腎功能比較[M(P25，P75)]

2.3 早期DN組患者尿外泌體miR-129、尿HMGB1和空腹血糖以及腎功能的關(guān)系 經(jīng)Pearson相關(guān)分析，早期DN患者尿外泌體miR-129表達(dá)與尿HMGB1水平、UALB/Cr比值均呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，與eGFR則呈正相關(guān)性(P<0.05)。而尿HMGB1與空腹血糖水平和UALB/Cr比值均呈正相關(guān)性(P<0.05)，與eGFR則呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)。見表3。

表3 早期DN組患者尿外泌體miR-129、尿HMGB1水平和空腹血糖、UALB/Cr、eGFR的關(guān)系

2.4 miR-129和HMGB1靶向調(diào)控關(guān)系 經(jīng)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)分析，miR-129存在與HMGB1 mRNA相結(jié)合的互補(bǔ)序列。經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因分析，miR-129mimics和HMGB1-3’UTR-WT1或HMGB1-3’UTR-WT2共轉(zhuǎn)染后，可降低熒光素酶活性(P<0.05)。見圖2。

圖2 miR-129和HMGB1靶向調(diào)控關(guān)系(a.與pmirGLO-HMGB1-WT1或pmirGLO-HMGB1-MUT1共轉(zhuǎn)染；b.與pmirGLO-HMGB1-WT2或pmirGLO-HMGB1-MUT2共轉(zhuǎn)染)

2.5 尿外泌體miR-129、尿HMGB1水平對(duì)早期DN的診斷價(jià)值 經(jīng)ROC曲線分析，尿外泌體miR-129、尿HMGB1診斷早期DN的AUC分別為0.83(95%可信區(qū)間0.76～0.91)和0.72(95%可信區(qū)間0.63～0.80)，靈敏度為76.3%和63.4%，特異度為77.5%和72.0%。而聯(lián)合診斷的AUC為0.96(95%可信區(qū)間0.90～0.99)，靈敏度和特異度分別為90.0%和91.8%。見圖3。

圖3 尿外泌體miR-129和尿HMGB1診斷早期DN的ROC曲線(a.尿外泌體miR-129;b.尿HMGB1;c.尿外泌體miR-129+尿HMGB1)

3 討論

近年來(lái)，DN的發(fā)病率不斷上升，其致病機(jī)制較復(fù)雜[8-9]。HMGB1是一種高度保守的核DNA結(jié)合蛋白，通過(guò)穩(wěn)定核小體的形成促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，其亦可以被釋放到細(xì)胞外，進(jìn)入血液循環(huán)或尿液中，成為促炎細(xì)胞因子或組織損傷的報(bào)警信號(hào)[10-11]。細(xì)胞外HMGB1亦參與了一些炎性疾病的進(jìn)展，如感染性休克、腎組織損傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[12-14]。有研究表明，HMGB1可能是導(dǎo)致腎損傷的潛在因素[15]。本研究顯示，早期DN組患者尿HMGB1表達(dá)水平高于非糖尿病人群和單純糖尿病人群。這說(shuō)明，在糖尿病腎損傷早期，HMGB1的表達(dá)已經(jīng)發(fā)生變化。外泌體由大多數(shù)細(xì)胞釋放，可以從包括尿液在內(nèi)的所有生物體中分離，其可通過(guò)轉(zhuǎn)移生物活性分子來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞間的通訊，包括miRNAs[16]。因此，外泌體有可能成為發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的靶向物質(zhì)來(lái)源，且不需要侵入性組織活檢就能提供診斷和病理生理學(xué)信息。有研究表明，miRNAs在介導(dǎo)外泌體對(duì)受體細(xì)胞的影響方面發(fā)揮重要作用，且其在內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙方面具有治療潛力[17]。miR-129作為血管生成、血管修復(fù)、炎癥激活和細(xì)胞凋亡等內(nèi)皮細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)因子，其大多數(shù)靶基因與內(nèi)皮細(xì)胞活化和炎癥相關(guān)，包括HMGB1等[18]。本研究通過(guò)TargetScan在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，HMGB1 mRNA可能含有2個(gè)與miR-129結(jié)合的靶向位點(diǎn)。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因分析，miR-129mimics和HMGB1-3’UTR-WT1或HMGB1-3’UTR-WT2共轉(zhuǎn)染后，可降低熒光素酶活性。且早期DN組患者尿外泌體miR-129表達(dá)水平與尿HMGB1蛋白水平呈負(fù)相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，早期DN患者尿外泌體miR-129表達(dá)低于非糖尿病人群和單純糖尿病患者，同時(shí)尿HMGB1水平高于非糖尿病人群和單純糖尿病患者，兩者具有負(fù)相關(guān)性，且與腎功能指標(biāo)(UALB/Cr比值、eGFR)變化亦密切相關(guān)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，尿外泌體miR-129和尿HMGB1蛋白水平對(duì)于早期DN有一定的診斷價(jià)值。

綜上所述，早期DN患者尿外泌體miR-129表達(dá)降低，HMGB1蛋白水平升高，這兩個(gè)指標(biāo)對(duì)于DN的早期診斷均有一定的臨床價(jià)值，且miR-129/HMGB1軸有可能成為未來(lái)預(yù)防或治療DN的新靶點(diǎn)。