闕冬梅，梁國雄，楊娟，唐渝璐

中山陳星海醫(yī)院皮膚科，廣東 中山 528415

淺部真菌病是皮膚病中的常見病、多發(fā)病，其中足癬最為常見，尤其是在溫暖潮濕的南方地區(qū),春夏季節(jié)發(fā)病率非常高，因此需要一種簡單、快速、準(zhǔn)確的檢測方法。KOH濕片法真菌鏡檢是既往最常用且有效的方法，但步驟相對繁瑣，制片時間偏長，背景雜亂，真菌結(jié)構(gòu)不易分辨和判斷，易出現(xiàn)假陰性或漏診。近年來熒光染色法真菌鏡檢得到越來越多的應(yīng)用，本研究比較熒光染色法和KOH濕片法在不同類型足癬中的檢出率和閱片時間，以供臨床參考。

1 對象與方法

1.1 病例選擇

收集我院皮膚科門診2018年8月至2020年7月擬診為足癬病例300例，其中118例擬診為水皰鱗屑型足癬，104例擬診為角化過度型足癬，78例擬診為浸漬糜爛型足癬。本研究通過醫(yī)院倫理審查，實驗前患者均簽署知情同意書。

1.2 設(shè)備與試劑

奧林巴斯CX23顯微鏡(增加熒光模塊，日本奧林巴斯公司)；皮膚真菌檢測系統(tǒng)(2016年版)。10%KOH溶液(實驗室自配)；真菌熒光染色液(Baso,珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

每個病例取材標(biāo)本分成2份，分別采用熒光染色法和KOH濕片法真菌鏡檢。步驟如下：①取材：75%酒精消毒患處后，用鈍刀刮取鱗屑或者皰液或者浸漬的表皮。皮損選取原則：水皰鱗屑型足癬選取鱗屑和皰液，角化過度型足癬刮除表面鱗屑后選擇底部的鱗屑，浸漬糜爛型足癬刮除白色浸漬表皮，再采集皮損的邊緣。②檢測：KOH濕片法：加1滴10%KOH，覆蓋玻片，酒精燈微加熱，輕壓蓋玻片，用濾紙吸去周圍溢液，置于光學(xué)顯微鏡下觀察；熒光染色法：加1滴熒光染色液，停留10 s后覆蓋玻片，輕壓后用濾紙吸去溢出染色液，置于熒光顯微鏡下觀察。③分別統(tǒng)計不同類型足癬使用兩種檢測方法的陽性和陰性例數(shù)，以及各自閱片時間(只統(tǒng)計陽性病例)。

1.4 陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)

由兩個檢測員進(jìn)行讀片，兩人均看到菌絲或者孢子時判斷陽性。當(dāng)出現(xiàn)同一份標(biāo)本判讀結(jié)果不一致時，由第三位檢測員進(jìn)行判定。判斷陰性的標(biāo)本需要閱讀整個玻片。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩種方法陽性率比較采用配對設(shè)計卡方檢驗或Fisher確切概率法，閱片時間的比較采用配對設(shè)計t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光染色法與KOH濕片法直接鏡檢鏡下結(jié)構(gòu)特點

熒光染色法鏡下菌絲及孢子發(fā)出亮藍(lán)色的熒光,與周圍的淡藍(lán)色背景形成鮮明對比，菌絲及孢子結(jié)構(gòu)清晰可見，與周圍角質(zhì)細(xì)胞容易區(qū)分。部分臨床病例真菌形態(tài)清晰可見，似培養(yǎng)狀態(tài)下的菌絲結(jié)構(gòu)，可初步根據(jù)形態(tài)特征對致病菌種進(jìn)行提示性診斷(圖1A)。即使極少量菌絲的情況下也能明確區(qū)分，斷裂的菌絲片段分隔清晰可見，容易與污染雜質(zhì)區(qū)分(圖1B)。熒光染色下植物纖維素也會被熒光標(biāo)記，但大小形態(tài)不同，形態(tài)不規(guī)則，邊緣銳利，無菌絲和橫隔，與片段化的菌絲可明確區(qū)別(圖1C)。

圖1 熒光染色法真菌鏡檢(400×) 1A:菌絲及孢子結(jié)構(gòu)清晰可見，部分情況下呈現(xiàn)培養(yǎng)狀態(tài)下的菌絲形態(tài);1B:斷裂的菌絲片段，結(jié)構(gòu)清晰，可見典型分隔;1C:被熒光標(biāo)記的植物纖維素，形態(tài)不規(guī)則且沒有分隔

KOH濕片法鏡下背景雜亂，菌絲及孢子與脂滴、氣泡、雜質(zhì)等不易分辨(圖2)。

圖2 KOH濕片法真菌鏡檢(400×):菌絲及孢子結(jié)構(gòu)不清晰，容易與周圍雜質(zhì)混淆Fig.2 Under microscopy with KOH wet-mount (400×), unclear hyphae and spore structure, non-differentiable from surrounding impurities.

2.2 不同類型足癬使用兩種檢測方法的陽性率比較

在水皰鱗屑型、角化過度型、浸漬糜爛型三種不同類型的足癬中,熒光染色法檢測陽性率分別為91.53%(108/118)、75.96%(79/104)、98.72%(77/78);KOH濕片法陽性率分別為80.51%(95/108)、47.12%(49/104)、97.44%(76/78)。兩種方法陽性率在水皰鱗屑型和角化過度型足癬中差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(2值分別為5.33、20.45，P值均<0.05)，而在浸漬糜爛型足癬中無明顯差異(2=7.93，P=0.062)，詳見表1。

表1 熒光染色法和KOH濕片法真菌鏡檢陽性率比較Tab.1 Comparison of the positive rates of various specimens under direct microscopy between fluorescent staining and KOH

2.3 不同類型足癬使用兩種檢測方法的閱片時間比較

熒光染色法與KOH濕片法檢測水皰鱗屑型足癬閱片時間分別為(65.23±10.60) s、(90.75±12.15) s，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.51，P<0.05);檢測角化過度型足癬閱片時間分別為(90.52±13.23) s、(150.35±15.16) s，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.60，P<0.05);檢測水皰鱗屑型足癬閱片時間分別為(38.13±8.62) s、(48.28±16.20) s，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.35，P<0.05)。

3 討論

足癬由于傳染性強，通過共用鞋襪即可發(fā)生感染，人群發(fā)病率高。根據(jù)臨床表現(xiàn)通常分為3種類型，即水皰鱗屑型、角化過度型及浸漬糜爛型[1]。癥狀通常輕微，除瘙癢以外可無任何不適，患者重視度不夠，常不治療或者是自行隨意購買外用藥治療，以上情況可導(dǎo)致足癬類型發(fā)生改變或?qū)е码y以辨認(rèn)足癬的出現(xiàn)。

KOH濕片法是臨床上直接鏡檢使用最早、最廣的方法，該法操作簡單、快捷、不需要特殊儀器。但KOH濕片法對真菌無染色強化作用，背景雜亂，需要操作者根據(jù)經(jīng)驗判讀，有時會出現(xiàn)假陰性或者假陽性的情況。熒光染色技術(shù)使用特殊的熒光染料，可以特異性結(jié)合真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)和葡聚糖，在熒光顯微鏡下熒光標(biāo)記的真菌易于觀察，形態(tài)清晰，提高了真菌鏡檢的敏感性。基于鏡下形態(tài)特征，還可以進(jìn)一步對致病真菌菌種進(jìn)行提示性診斷，更具有臨床價值[2]。免疫熒光法容易掌握，操作與KOH濕片法一致，且一步到位，無需加熱和等待時間，耗時短，結(jié)果更直觀。既往研究表明熒光染色法在特殊標(biāo)本如菌量少、毛發(fā)、甲屑或者經(jīng)治標(biāo)本等檢測中陽性率更高，在頭癬和甲癬的診斷中更有優(yōu)勢[3-5]。

本研究比較熒光染色法和KOH濕片法檢測收集到的不同類型足癬發(fā)現(xiàn)，水皰鱗屑型足癬和角化過度型足癬熒光染色法陽性率明顯高于KOH濕片法，尤其是菌絲量少的角化過度型足癬，研究結(jié)果與既往類似報道一致[6]。但在浸漬糜爛型足癬中，兩種方法的陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮與浸漬糜爛型足癬真菌生長活躍，真菌量多，不容易漏診和誤診有關(guān)。這與杜鵬等[7]研究的熒光染色法在疑難標(biāo)本如外涂藥膏標(biāo)本、色素減退型花斑癬皮屑、用藥后復(fù)查標(biāo)本，尤其是甲標(biāo)本中的檢查中有明顯優(yōu)勢的結(jié)論相一致。

在菌量少、菌絲容易出現(xiàn)片段化的角化過度型足癬中，兩種方法閱片時間均較長，但熒光染色法明顯短于KOH濕片法。既往研究[4-5]發(fā)現(xiàn)熒光染色法在其他類型的淺部真菌感染檢測中也能明顯縮短閱片時間。本研究顯示閱片時間在三種類型足癬中熒光染色法均短于KOH濕片法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

熒光染色法可將菌絲染色，從而與周圍細(xì)胞和雜質(zhì)區(qū)分且真菌結(jié)構(gòu)顯示清晰，但植物纖維素也可以被熒光標(biāo)記，尤其與斷裂的片段化菌絲容易混淆，需要特別注意。本研究清晰地展示了兩者的區(qū)別。既往研究[8]也有類似結(jié)論。

綜上所述，熒光染色法檢測水皰鱗屑型足癬和角化過度型足癬真菌感染優(yōu)于KOH濕片法，尤其是在菌量少，出現(xiàn)片段化菌絲的角化過度型足癬的標(biāo)本中，且耗時短，值得臨床推廣應(yīng)用。