陳紅剛， 趙文龍， 晉 玲， 李 巖， 劉孜瀚， 杜 弢*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)， 甘肅 蘭州 730000；2.甘肅百草中藥材種植有限公司， 甘肅 蘭州 730000)

紅花綠絨蒿(MeconopsispuniceaMaxim．)為罌粟科綠絨蒿屬草本植物，藏名“阿柏幾麻魯”，主要分布于青藏高原邊緣的四川西北部、西藏東北部、青海東南部和甘肅西南部海拔2 800～4 300 m的高山灌叢、林緣、山坡草甸[1]。紅花綠絨蒿具有清熱、鎮(zhèn)痛、降壓、止咳、利尿、固澀、解毒、抗菌等功效，作為傳統(tǒng)藏藥材，可治遺精、肺結(jié)核、肺炎、痛經(jīng)、白帶、高血壓等[2]。

紅花綠絨蒿目前基本為野生，其所處的生態(tài)環(huán)境脆弱，資源蘊(yùn)藏量有限。近年來(lái)，因生境退化、過(guò)度采集等自然環(huán)境和人為因素的影響，紅花綠絨蒿野生資源遭到嚴(yán)重破壞，面臨著枯竭的危險(xiǎn)[3]。1999年我國(guó)將紅花綠絨蒿列為國(guó)家二級(jí)瀕危保護(hù)植物[4-5]。由于紅花綠絨蒿種子具有休眠現(xiàn)象[6-7]，自然萌發(fā)率低，目前尚無(wú)人工培育成功的報(bào)道。因此，本試驗(yàn)研究紅花綠絨蒿種子休眠特性，探索打破種子休眠、提高種子萌發(fā)率的方法，旨在為紅花綠絨蒿野生撫育及人工馴化栽培提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

紅花綠絨蒿種子于2018年8月采自青海省久治縣隆格山野生植株，海拔4 317 m (100°51′12.96″ E，33°17′13.49″ N)，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)晉玲教授鑒定為紅花綠絨蒿(MeconopsispuniceaMaxim.)種子，陰干后室溫儲(chǔ)存。

油菜(Brassicanapus)種子由蘭州市種子管理局提供。

1.2 方法

1.2.1紅花綠絨蒿種子凈度、千粒重測(cè)定 參照GB/T3543對(duì)紅花綠絨蒿種子進(jìn)行凈度[8]、千粒重[9]的測(cè)定。

1.2.2紅花綠絨蒿種子吸水率的測(cè)定 隨機(jī)稱取風(fēng)干紅花綠絨蒿種子2份，每份1.0 g，1份不做處理(CK)，1份用砂紙輕微打磨種皮，以不露出胚乳為宜，分別浸泡于蒸餾水中，在0，2，4，6，8，10，12，14 h取出種子用濾紙吸干種子表面水分，精密稱重(0.0001 g)，重復(fù)3次[10-11]。按下列公式計(jì)算種子吸水率。

1.2.3紅花綠絨蒿種子抑制物提出及生物活性測(cè)驗(yàn)[12-14]隨機(jī)稱取風(fēng)干紅花綠絨蒿種子2份，每份5.0 g，分別用研缽磨碎，裝入100 mL的磨口錐形瓶中，分別加入10倍量的蒸餾水或80%乙醇，蓋瓶塞，置4℃冰箱中恒溫浸提24 h，5 000 r·min-1離心10 min后過(guò)濾，將殘?jiān)^續(xù)按相同方法浸提2次，合并3次浸提液，56℃條件下蒸干，加適量水溶解，定容至25 mL，即得0.20 g·mL-1的種子提取液(g·mL-1指每毫升溶液所含提取前紅花綠絨蒿種子的質(zhì)量)。

以0.20 g·mL-1的提取液為母液，配成0(CK)，0.05，0.10，0.15，0.20 g·mL-1的提取液各10 mL，依次將各濃度提取液加入培養(yǎng)皿中，每個(gè)濃度處理3皿，每皿1.5 mL，再鋪2層濾紙于培養(yǎng)皿中，完成發(fā)芽床的制備。以油菜種子為生物活性測(cè)驗(yàn)材料，隨機(jī)選取油菜種子1500粒，隨機(jī)分成15份，每份100粒，播種于制備好的發(fā)芽床上，在恒溫20℃、光照12 h·d-1的條件下培養(yǎng)，及時(shí)補(bǔ)充水分，24 h統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，48 h統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)。

1.2.4紅花綠絨蒿種子低溫沙藏 隨機(jī)稱取風(fēng)干紅花綠絨蒿種子2份，每份1.6 g，1份不做沙藏處理(4℃冰箱中保存)，1份低溫沙藏。具體沙藏方法如下：將洗凈的河沙篩成粗沙(18目)和細(xì)沙(40目)，經(jīng)高溫滅菌(121℃,30 min)后，在容器底部鋪粗沙3～5 cm，再鋪細(xì)沙5～10 cm，將稱好的紅花綠絨蒿種子用蒸餾水浸泡16 h后裝入紗布網(wǎng)袋中，平鋪于細(xì)沙上，再蓋細(xì)沙5～10 cm，沙子濕度為10%～12%，用保鮮膜封住容器，打孔透氣，將容器置于冰箱中。變溫程序?yàn)棰耠A段4～7℃沙藏30 d，Ⅱ階段0～4℃沙藏30 d，Ⅲ階段0℃沙藏30 d，Ⅳ階段-4～0℃沙藏30 d，沙藏結(jié)束后將紗布網(wǎng)袋從沙子中取出，倒出種子，于通風(fēng)處陰干后過(guò)篩，獲得干凈待測(cè)種子。

1.2.5紅花綠絨蒿種子結(jié)構(gòu)分析與胚率測(cè)定 隨機(jī)選取沙藏與未沙藏紅花綠絨蒿種子各10粒，蒸餾水浸泡16 h，OCT膠水包埋冷凍5 min(-20℃)，Leica-CM1950型恒冷切片機(jī)切片(厚約0.15 mm)，LeicaDM500顯微鏡觀察種子結(jié)構(gòu)，測(cè)量胚率。計(jì)算公式如下：

1.2.6紅花綠絨蒿種子發(fā)芽指標(biāo)測(cè)定 隨機(jī)選取沙藏與未沙藏紅花綠絨蒿種子各300粒，用0.1%的升汞消毒10 min，蒸餾水沖洗5次，播于沙床上(細(xì)沙2～3 mm)，每皿播種50粒，6次重復(fù)，以未沙藏種子為對(duì)照(CK)，在10℃全黑暗條件下培養(yǎng)，及時(shí)補(bǔ)足水分，計(jì)算發(fā)芽率，第7 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)。計(jì)算公式如下：

1.2.7紅花綠絨蒿種子自然層積 隨機(jī)稱取風(fēng)干紅花綠絨蒿種子4份，每份5.0 g，1份于4℃冰箱中保存(CK)，另外3份分別均勻鋪裝于孔徑0.8～1.0 mm的尼龍網(wǎng)袋中，埋藏在海拔3 491 m的紅花綠絨蒿野外適生區(qū)，土壤濕度20%～40%，埋藏深度為處理Ⅰ(5 cm)、處理Ⅱ(10 cm)、處理Ⅲ(15 cm)，埋藏時(shí)間150 d(第一年11月至翌年3月)，取出后用蒸餾水將種子清洗干凈，按照1.2.6進(jìn)行種子發(fā)芽率測(cè)定。

1.2.8數(shù)據(jù)分析 使用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及作圖，SPSS 17.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅花綠絨蒿種子形態(tài)、凈度及千粒重

紅花綠絨蒿種子呈腎形，黑色或黃褐色(圖1)，長(zhǎng)和寬分別為2.02～3.28 mm和1.04～1.90 mm，千粒重0.7919 g，凈度96.84%。

2.2 紅花綠絨蒿種子吸水率

由圖2可知，紅花綠絨蒿種子0～2 h吸水率急劇增大，4 h時(shí)達(dá)到最大吸水率且趨于穩(wěn)定，10 h之后達(dá)到飽和狀態(tài)，未處理及磨損種皮的紅花綠絨蒿種子吸水規(guī)律一致，最大吸水率分別為83.25%和91.58%，吸水過(guò)程符合種子的一般吸水規(guī)律，表明種皮并不影響水分進(jìn)入紅花綠絨蒿種子內(nèi)部。

圖1 紅花綠絨蒿種子形態(tài)

圖2 紅花綠絨蒿種子吸水率

2.3 紅花綠絨蒿種子生物活性測(cè)定

由圖3、圖4可知，油菜種子發(fā)芽率隨紅花綠絨蒿種子浸提液濃度的增大而降低，根長(zhǎng)隨提取液濃度的增大而減小，當(dāng)提取液濃度達(dá)到0.15 g·mL-1時(shí)，醇提液對(duì)油菜種子的發(fā)芽抑制率達(dá)到了100.00%，水提液對(duì)油菜種子發(fā)芽抑制率和根長(zhǎng)抑制率分別達(dá)到91.33%和83.52%，各濃度水提液和醇提液對(duì)油菜種子發(fā)芽和胚根生長(zhǎng)的抑制作用與對(duì)照(CK)均有顯著性差異(P<0.05)。說(shuō)明紅花綠絨蒿種子內(nèi)含有萌發(fā)抑制物質(zhì)，對(duì)油菜種子發(fā)芽和胚根生長(zhǎng)有抑制作用，且醇提物抑制作用強(qiáng)于水提物。

2.4 沙藏對(duì)紅花綠絨蒿種子胚率及發(fā)芽情況的影響

紅花綠絨蒿種子由種皮、胚、胚乳3部分組成，未沙藏種子的胚發(fā)育時(shí)期多處于球形或心形胚時(shí)期(圖5-a，5-b)，胚率為23.30%，沙藏處理后種子的胚發(fā)育時(shí)期多處于子葉形胚時(shí)期(圖5-c)，胚率為65.80%，與對(duì)照(CK)差異極顯著(P<0.01)。未沙藏的紅花綠絨蒿種子均不能發(fā)芽，沙藏處理后種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)有了顯著提高，分別達(dá)到50.00%和47.67%，與對(duì)照(CK)差異極顯著(P<0.01，圖6)。

圖3 紅花綠絨蒿種子提取物對(duì)油菜種子發(fā)芽的影響

圖4 紅花綠絨蒿種子提取物對(duì)油菜種子胚根生長(zhǎng)的影響

2.5 自然層積對(duì)紅花綠絨蒿種子發(fā)芽情況的影響

由圖7可知，未處理的紅花綠絨蒿種子均不能發(fā)芽，野外自然層積可以提高種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)，處理Ⅰ(5 cm)、處理Ⅱ(10 cm)、處理Ⅲ(15 cm)較未處理(CK)均差異極顯著(P<0.01)，且以埋藏深度為10 cm時(shí)效果最好，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)分別達(dá)到63.34%和49.67%。

圖5 沙藏前后紅花綠絨蒿種子胚的形態(tài)

圖6 沙藏對(duì)紅花綠絨蒿種子胚率及發(fā)芽情況的影響

圖7 自然層積對(duì)紅花綠絨蒿種子發(fā)芽情況的影響

3 討論

種子物理休眠是由種皮不透水層引起的一種休眠類型[15]。本研究中未處理及磨損種皮的紅花綠絨蒿種子吸水規(guī)律一致，浸泡4 h種子最大吸水率分別為 83.25%和91.58%，說(shuō)明種皮對(duì)其萌發(fā)不造成透性障礙。種子內(nèi)部存在抑制物質(zhì)是種子休眠的主要原因之一[16]。紅花綠絨蒿種子水提液和醇提液對(duì)油菜種子發(fā)芽和胚根生長(zhǎng)均有顯著抑制作用(P<0.05)，說(shuō)明紅花綠絨蒿種子內(nèi)含有萌發(fā)抑制物質(zhì)，具有生理休眠的特性[17]，且醇提物抑制作用強(qiáng)于水提物。但是，內(nèi)源抑制物質(zhì)在休眠性種子中普遍存在，種類繁多[18]，紅花綠絨蒿種子中存在的萌發(fā)抑制物質(zhì)類型還有待進(jìn)一步研究。

趙春香等[19]等研究表明低溫沙藏處理有利于銀杏(Ginkgobiloba)種子種胚增長(zhǎng)。陳疏影等[20]研究指出，對(duì)深度休眠的滇重樓(Parispolyphyllavaryunnanensis)種子進(jìn)行層積處理，可使種子提前進(jìn)入形態(tài)及生理后熟，快速促進(jìn)胚的發(fā)育，提前解除種子的休眠期。紅花綠絨蒿種子經(jīng)低溫沙藏處理后，種子胚率由未處理時(shí)的23.30%增長(zhǎng)到65.80%，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)由不發(fā)芽上升到50.00%和47.67%，較對(duì)照(CK)顯著提高(P<0.01)，說(shuō)明紅花綠絨蒿具有形態(tài)休眠的特性[21]，而低溫沙藏能使紅花綠絨蒿種子完成形態(tài)生理后熟，是打破紅花綠絨蒿種子休眠的有效方法。

休眠的種子可以在不適宜幼苗生長(zhǎng)的情況下阻止種子萌發(fā)，減少子代在惡劣環(huán)境萌發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，一定程度上保障了種群的延續(xù)[22]。紅花綠絨蒿作為珍稀瀕危的藏藥資源，主要分布于自然環(huán)境惡劣的青藏高原地區(qū)，為了適應(yīng)該地區(qū)的自然環(huán)境及延續(xù)種群，種子需完成對(duì)青藏高原地區(qū)環(huán)境因素的響應(yīng)才能萌發(fā)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)在紅花綠絨蒿野外適生區(qū)進(jìn)行自然層積是解決種子休眠的有效方法，閆芳等[24]在黃瑞香(Daphnegiraldii)種子上也有類似發(fā)現(xiàn)，而通過(guò)模擬紅花綠絨蒿野外適生區(qū)地下10 cm處土壤溫度及濕度條件對(duì)種子進(jìn)行層積處理的方法，也為解決該地區(qū)同類植物種子的休眠問(wèn)題提供了參考。

4 結(jié)論

紅花綠絨蒿種子由種皮、胚、胚乳3部分組成，種胚未發(fā)育成熟，種子內(nèi)含有萌發(fā)抑制物質(zhì)，種皮對(duì)其萌發(fā)不造成透性障礙。根據(jù)Baskin對(duì)種子休眠的分類，紅花綠絨蒿種子休眠類型為深度復(fù)雜形態(tài)生理休眠(deep complex，MPD)[25]。低溫層積是破除紅花綠絨蒿種子休眠的有效方法。