孫明雪， 張玉霞*， 叢百明， 王顯國， 田永雷， 張慶昕， 杜曉艷

(1. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 通遼 028041； 2. 內(nèi)蒙古通遼市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所， 內(nèi)蒙古 通遼 028000；3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院， 北京 100083； 4. 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

苜蓿(MedicagosativaL.)作為優(yōu)良的高蛋白牧草在我國北方科爾沁沙地廣泛種植，但由于此地區(qū)生存環(huán)境惡劣、冬季降水少、北風(fēng)風(fēng)力極大，經(jīng)常出現(xiàn)持續(xù)性-25℃以下低溫天氣，致使苜蓿凍害嚴(yán)重，不能正常返青，進(jìn)而嚴(yán)重影響生產(chǎn)效益[1]。國內(nèi)外諸多學(xué)者探究苜?？购纳砩瘷C制，為培育高產(chǎn)抗寒苜蓿品種提供了有力的理論支持[2-5]，其中對糖類物質(zhì)與苜蓿抗寒性相關(guān)性表明，可溶性糖具有滲透調(diào)節(jié)作用，是苜蓿抗寒保護(hù)物質(zhì)[6-7]。亦有研究表明糖類物質(zhì)中的葡萄糖、果糖、蔗糖和低聚合度的果聚糖均可能是抵抗低溫脅迫的抗寒保護(hù)物質(zhì)[8]，但關(guān)于苜蓿糖類物質(zhì)與抗寒性關(guān)系的研究尚存在爭議。Volenec[9]研究表明紫花苜蓿根部淀粉含量在秋冬季節(jié)呈下降趨勢，而蔗糖含量升高，但趙宇光[10]試驗結(jié)果表明可溶性總糖在野生黃花苜蓿和紫花苜蓿間的差異不顯著，并不與種間的抗凍性呈正相關(guān)，Bush[11]也認(rèn)為糖類物質(zhì)在植物抗凍性中所扮演的角色不是很確定，在種間可能存在不同。為此，本試驗在科爾沁典型沙化土地種植黃花苜蓿和4個紫花苜蓿品種，利用程序式低溫處理箱進(jìn)行低溫處理，采用電導(dǎo)法協(xié)同Logistic回歸方程計算苜蓿半數(shù)致死溫度(LT50)，確定苜蓿耐寒閾值，通過LT50與苜蓿根頸糖類物質(zhì)的相關(guān)性研究，分析苜蓿的抗寒性差異及其與糖類物質(zhì)的相關(guān)性，為抗寒苜蓿品種的選育和安全越冬栽培技術(shù)調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)自然概況

試驗地位于內(nèi)蒙古民族大學(xué)科技園區(qū)，地理位置為北緯43°30′ N，東經(jīng)122°27′ E。年平均氣溫5.5℃，≥10℃年積溫為3 000～3 200℃，無霜期140～150 d，年平均降水量約375 mm，年平均風(fēng)速3.0～4.4 m·s-1，土壤為沙壤土。沙壤土具有透氣性較好、保水保肥抗旱能力較差、土溫變幅較大等特點。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，種植黃花苜蓿和4個紫花苜蓿主栽品種(‘騎士T’、‘北極熊’、‘草原3號’和‘巨能3010’)，每個處理設(shè)4次重復(fù)，共20個小區(qū)，小區(qū)面積4 m×5 m=20 m2，四周設(shè)保護(hù)行。于2019年7月15日播種，條播行距 15 cm，播種時一次性施入30，200，150 kg·hm-2(純氮、P2O5、K2O)的氮、磷、鉀肥，供試肥料為尿素(N 46.3%)、過磷酸鈣(P2O514%)、鉀肥為硫酸鉀(K2O 50%)。灌溉方式為指針式噴灌。

于封凍期前(11月15日)挖取苜蓿越冬器官，4℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。每個材料平均分成6份，每份30株苜蓿，裝入干凈的塑料袋中，其中1份作為對照(4℃)，其余5份放入程序式低溫處理箱(溫度誤差為±1℃)進(jìn)行分批低溫處理。處理時采用脫脂棉包裹，加水適量，再用錫紙包裹，注明編號，低溫處理溫度分別為-10℃，-15℃，-20℃，-25℃和-30℃，按照4℃每小時的速率降溫，到達(dá)設(shè)定溫度后保持6 h，然后按照4℃每小時的速率升至4℃，取出置于冰箱4℃下保持12 h，測定苜蓿根頸相對電導(dǎo)率和糖類物質(zhì)含量。

1.3 苜蓿材料來源

苜蓿材料來源見表1。

表1 苜蓿材料名稱及來源

1.4 測定指標(biāo)及方法

采用DDS-302電導(dǎo)率儀法測定電導(dǎo)率并計算相對電導(dǎo)率[12]；采用蒽酮比色法測定可溶性糖和淀粉含量[12]；采用二硝基水楊酸法和間苯二酚法測定蔗糖和果糖含量[13]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel軟件處理、制作表格，SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差顯著性分析，采用Duncan檢驗方法進(jìn)行多重比較，根據(jù)相對電導(dǎo)率擬合Logistic方程，并計算半致死溫度(LT50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿的抗寒性差異及評價方法

如表2所示，隨著脅迫溫度的降低，苜蓿根頸的相對電導(dǎo)率呈增加趨勢，其中‘騎士T’、‘北極熊’、‘巨能3010’和‘草原3號’紫花苜蓿品種根頸的相對電導(dǎo)率在-15℃處理開始較CK和-10℃處理顯著增加(P<0.05)；黃花苜蓿在-20℃處理開始較CK,-10℃和-15℃處理增加顯著(P<0.05)。進(jìn)一步根據(jù)苜蓿根頸相對電導(dǎo)率結(jié)合Logistic回歸分析，并計算苜蓿的半數(shù)致死溫度，表明黃花苜蓿和4個紫花苜?？购芰ε判驗辄S花苜蓿>‘北極熊’>‘草原3號’>‘巨能3010’>‘騎士T’。在-15℃處理下黃花苜蓿根頸相對電導(dǎo)率顯著低于‘巨能3010’(P<0.05)，在-20℃處理下黃花苜蓿和‘北極熊’相對電導(dǎo)率顯著低于‘騎士T’和‘巨能3010’(P<0.05)。

表2 低溫脅迫苜蓿根頸相對電導(dǎo)率的變化及LT50值

2.2 低溫脅迫下苜蓿根頸中可溶性糖類物質(zhì)的變化

如表3所示，黃花苜蓿和4個紫花苜蓿品種根頸中可溶性糖含量隨低溫脅迫溫度的降低呈先增加后降低的變化趨勢，其中黃花苜蓿和‘北極熊’在不同低溫處理下可溶性糖含量無顯著性變化；‘騎士T’、‘草原3號’和‘巨能3010’分別在-20℃,-15℃和-10℃處理下可溶性糖含量達(dá)到最大值。-20℃處理下‘騎士T’苜蓿根頸的可溶性糖含量顯著高于黃花苜蓿以外的其他紫花苜蓿品種(P<0.05)；-25℃,-30℃處理下‘巨能3010’苜蓿根頸的可溶性糖含量顯著高于‘騎士T’紫花苜蓿品種(P<0.05)。

表3 低溫脅迫對苜蓿根頸可溶性糖含量的變化

2.3 低溫脅迫下苜蓿根頸中淀粉含量的變化

如表4所示黃花苜蓿和4個紫花苜蓿品種根頸淀粉含量受低溫脅迫影響呈降低趨勢。-25℃處理下黃花苜蓿和‘騎士T’根頸淀粉含量顯著低于-10℃處理(P<0.05)；‘草原3號’和‘巨能3010’分別在-20℃和-15℃處理下根頸淀粉含量顯著低于-10℃處理(P<0.05)；‘北極熊’在—30℃處理下根頸淀粉含量顯著低于-10℃處理(P<0.05)。-10℃處理下‘巨能3010’根頸淀粉含量顯著高于黃花苜蓿和‘北極熊’、‘草原3號’(P<0.05)，低溫脅迫降低至-15℃和-20℃處理下，黃花苜蓿和4個紫花苜蓿品種間的淀粉含量無顯著性差異。

表4 低溫脅迫下苜蓿根頸淀粉含量的變化

2.4 低溫脅迫下苜蓿根頸中果糖含量的變化

如表5所示，黃花苜蓿和4個紫花苜蓿品種隨著低溫脅迫的加劇根頸中果糖含量呈增加-降低-增加的雙峰型變化趨勢，除‘北極熊’紫花苜蓿品種外其他苜蓿在-10℃處理下較對照顯著增加(P<0.05)。黃花苜蓿和‘騎士T’、‘草原3號’、‘巨能3010’紫花苜蓿在-25℃處理下最低，‘北極熊’在-20℃處理果糖含量最低；黃花苜蓿和4個紫花苜蓿品種在—30℃處理下出現(xiàn)第二峰，黃花苜蓿和‘北極熊’較最低值顯著增加(P<0.05)。-10℃處理下黃花苜蓿根頸果糖含量顯著高于4個紫花苜蓿(P<0.05)；-20℃和-25℃處理下黃花苜蓿和‘草原3號’果糖含量顯著高于‘騎士T’(P<0.05)，—30℃處理下黃花苜蓿和‘北極熊’果糖含量顯著高于‘騎士T’和‘巨能3010’(P<0.05)。

表5 低溫脅迫下苜蓿根頸果糖含量的變化

2.5 低溫脅迫下苜蓿根頸中蔗糖含量的變化

如表6所示，黃花苜蓿和4個紫花苜蓿根頸中蔗糖含量隨溫度脅迫的降低呈增加-降低-增加的雙峰型趨勢。除黃花苜蓿和‘北極熊’外在-15℃處理下其他品種根頸蔗糖含量較-10℃處理下顯著降低(P<0.05)，-20℃及更低溫度處理根頸中蔗糖含量呈增加再降低的趨勢，黃花苜蓿和‘草原3號’較-15℃增加顯著(P<0.05)。-25℃和—30℃處理下黃花苜蓿和‘北極熊’根頸淀粉含量顯著高于‘騎士T’和‘巨能3010’(P<0.05)，-20℃和-25℃處理下‘草原3號’和黃花苜蓿根頸淀粉含量顯著高于‘騎士T’和‘巨能3010’(P<0.05)。

2.6 苜蓿根頸中糖類物質(zhì)含量與LT50間的相關(guān)性分析

如表7所示,沙化草地-20℃處理下苜蓿根頸中淀粉含量與LT50呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，說明此溫度下測定苜蓿根頸中淀粉含量較高的品種，LT50越高，抗寒能力越差。-20℃溫度處理下果糖和蔗糖含量與其LT50呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，且果糖和蔗糖在—30℃處理與其LT50呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，果糖在-25℃處理與其LT50呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。說明-20℃及以下溫度下果糖和蔗糖含量較高的苜蓿品種，抗寒能力越強。

表7 半致死溫度與苜蓿根頸中糖類物質(zhì)的相關(guān)性

3 討論

Lyons[14]認(rèn)為，當(dāng)植物受到低溫脅迫時，細(xì)胞膜的透性會增大，電解質(zhì)會不同程度的滲漏，導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)損壞?？购暂^強品種的細(xì)胞在一定范圍內(nèi)不但能耐受低溫傷害，而且滲透性的變化可以逆轉(zhuǎn)，當(dāng)溫度回升時，細(xì)胞就能恢復(fù)正常。反之，抗寒性弱品種的細(xì)胞損傷不僅不能恢復(fù)正常甚至?xí)斐伤劳鯷14]。本試驗研究在-15℃處理下苜蓿根頸相對電導(dǎo)率值增加顯著，且各品種間出現(xiàn)差異，其中黃花苜蓿和‘北極熊’的相對電導(dǎo)率值顯著低于其他3個紫花苜蓿品種，說明其這兩個品種的苜蓿細(xì)胞膜透性小于其他苜蓿品種，電解質(zhì)滲漏較少，即細(xì)胞膜遭受破壞程度較輕，從而能說明黃花苜蓿和‘北極熊’抗寒能力較強。

低溫環(huán)境植物體內(nèi)會積累大量糖類物質(zhì)起到滲透調(diào)節(jié)作用，提高細(xì)胞的滲透勢，保護(hù)細(xì)胞的穩(wěn)定性以緩解其受到的傷害[15]。有研究表明可溶性糖還可以與細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng)達(dá)到保護(hù)細(xì)胞膜、原生質(zhì)及細(xì)胞器的作用[16]。喬潔等[17]研究表明可溶性糖含量是衡量苜?？购詮娙醯蔫b定指標(biāo)之一。本研究表明，黃花苜蓿和4個紫花苜蓿品種根頸中可溶性糖含量隨著溫度脅迫的降低呈增加-降低-增加的雙峰型趨勢，變化規(guī)律明顯，但低溫處理下苜蓿根頸中可溶性糖含量與其LT50無顯著性相關(guān)，說明苜蓿根頸中可溶性糖的積累量與其抗寒能力強弱無明顯關(guān)系，這與崔國文[18]的研究結(jié)果一致。

低溫脅迫下水解酶活性提升，導(dǎo)致大量淀粉快速分解為可溶性糖，提升細(xì)胞液濃度，通過減緩其水分流失和降低冰點增強其抗寒能力[19]。本研究表明黃花苜蓿和4個紫花苜蓿品種根頸中淀粉含量隨著脅迫溫度的降低呈降低的趨勢，相關(guān)分析表明-20℃處理下苜蓿根頸淀粉含量越高則抗寒能力越弱，Castonguay等[20]研究表明淀粉在越冬期間分解轉(zhuǎn)化成可溶性糖，從而提高苜蓿的抗寒性，與本文研究結(jié)果一致。

韓文軍[21]和郝培彤[22]研究結(jié)果表明與苜?？购杂幸欢ㄏ嚓P(guān)性的是碳水化合物中蔗糖和果糖含量。果糖、蔗糖和葡萄糖總稱為可溶性糖，而可溶性糖在植物抗寒方面起著重要作用。有研究表明，這些糖類不僅可以作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢，果糖還可以作為單糖發(fā)生磷酸化，從而引起糖信號傳遞使細(xì)胞對低溫作出反應(yīng)[23]。本試驗研究表明黃花苜蓿和4個紫花苜蓿品種隨著低溫脅迫的加劇根頸中果糖含量呈增加-降低-增加的趨勢。黃花苜蓿和4個紫花苜蓿品種根頸中蔗糖含量隨著溫度脅迫的降低變化規(guī)律不一致。相關(guān)分析表明-20℃及更低溫度處理下果糖和蔗糖含量與其LT50呈顯著負(fù)相關(guān)，說明低溫處理下積累果糖和蔗糖含量有利于提高苜?？购芰Α？扇苄蕴穷愔械钠渌穷?，如棉子糖、水蘇糖等寡糖類的積累是否與苜蓿抗寒能力有關(guān)以及該糖類物質(zhì)對苜蓿低溫脅迫的響應(yīng)機制是如何還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述，低溫處理下相對電導(dǎo)率擬合Logistic回歸方程計算苜蓿半數(shù)致死溫度，得出苜?？购耘判驗辄S花苜蓿>‘北極熊’>‘草原3號’>‘巨能3010’>‘騎士T’。-20℃處理下苜蓿根頸中淀粉含量、-20℃及以下低溫處理下果糖和蔗糖含量可以作為苜蓿衡量抗寒性強弱的敏感指標(biāo)，果糖和蔗糖是苜蓿越冬抗寒保護(hù)物質(zhì)。