蘇貝貝， 張 英， 道日娜

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院， 三江源區(qū)高寒草地生態(tài)省部共建重點實驗室， 青海 西寧 810016)

在草地生態(tài)系統(tǒng)中，豆科牧草作為特殊的功能組，對整個機制的運轉(zhuǎn)起著重要的作用[1]，并且其在營養(yǎng)價值方面也比禾本科牧草更為優(yōu)秀[2]，是牲畜的優(yōu)良飼料。近年來，社會經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展和人為活動的影響，以及自然環(huán)境等因素的干擾，共同導(dǎo)致了高寒地區(qū)土壤質(zhì)量下降、退化速度加快、生產(chǎn)力低下，從而嚴(yán)重制約了畜牧業(yè)生產(chǎn)和地區(qū)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展[3-5]。目前國內(nèi)對于豆科牧草的研究較多，諸多學(xué)者從生態(tài)系統(tǒng)角度、物質(zhì)能量循環(huán)角度及土壤理化特性角度進(jìn)行了分析[6]，對于豆科牧草根際微生物的研究也較多，主要集中在微生物的分離鑒定及資源庫的建立等方面[7]，而從土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的角度對豆科牧草的研究鮮有報道。

土壤生態(tài)系統(tǒng)中最具有生命活力的重要組成是土壤微生物[8-9]。土壤生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)以及功能不斷影響著微生物群落多樣性的變化[10]，進(jìn)而成為土壤肥力和生態(tài)保持方面不可或缺的重要因素[11-12]。由于土壤微生物對周邊環(huán)境具有敏銳的反應(yīng)能力，可以對外界的變化快速地做出響應(yīng)，從而對植物群落的物種多樣性和土壤結(jié)構(gòu)的形成產(chǎn)生一定的影響[13-14]。因此，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化不僅是衡量草地生態(tài)系統(tǒng)健康的條件之一，還是反映草地退化或恢復(fù)程度的指標(biāo)之一[15-17]。在對于可培養(yǎng)微生物研究方面，之前研究所采用的傳統(tǒng)DNA測序方法通常所取得的信息量少且耗時較長，很難使人們對土壤微生物群落進(jìn)行深入的研究。通過利用Illumina HiSeq PE250高通量測序技術(shù)可以較為全面地反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，并且相較于傳統(tǒng)DNA測序方法具有更高的準(zhǔn)確性和靈敏度等優(yōu)勢[18-19]。本研究采集同一地區(qū)4種豆科栽培牧草的根際土壤，通過研究土壤的理化性質(zhì)和微生物多樣性，以期揭示同一地區(qū)栽培豆科牧草根際土壤微生物多樣性的差異及變化規(guī)律，為高寒地區(qū)豆科牧草的可持續(xù)開發(fā)與利用以及植物根際土壤微生物的后續(xù)研究提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究樣地位于青海省牧草良種繁育場(35°15′28″ N，100°39′16″ E)，年平均氣溫為0.2℃，全年≥0℃的活動積溫為1 503.0℃，全年無絕對無霜期，年平均降水量為430.0 mm，年平均蒸發(fā)量為1 352.5 mm，平均海拔高程3 220 m。該地區(qū)海拔高，多風(fēng)而寒冷、夏季涼爽，適合牧草生長。

1.2 試驗設(shè)計和樣品采集

選擇4種豆科栽培牧草為研究對象，2019年4月20日進(jìn)行播種，種植面積為5 m×8 m，3次重復(fù)，條播，行距為40 cm，播種量分別為扁蓿豆(Melissilusruthenicus(L.)Peschkova(TrigonellaruthenicaL.))(樣品編號TDB)24 Kg·hm-2、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)(樣品編號TDZ)22.5 Kg·hm-2、紅豆草(Onobrychisviciifolia)(樣品編號TDH)30 Kg·hm-2、蠶豆(ViciafabaL.)(樣品編號TDC)220 Kg·hm-2，隨機區(qū)組試驗設(shè)計如圖1所示。2019年8月20日采樣，各處理田采用5點取樣法取樣，采集0～20 cm植物根系及土壤樣品，抖落根系大塊土壤，收集根上0～5 mm的土壤作為根際土[20]，立即裝入無菌密封袋，并低溫帶回實驗室，樣品分為兩份，一份于—80℃冰箱保存，用于DNA提取，另外一份風(fēng)干過篩用于土壤理化性質(zhì)的測定。

圖1 隨機區(qū)組試驗設(shè)計圖

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1土壤理化指標(biāo) 測定4種豆科栽培牧草根際土壤的理化性質(zhì)采用常規(guī)方法[21]：pH值的測定采用酸度計電位法；速效氮含量的測定采用氯化鉀浸提-分光光度計法；速效磷含量的測定采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法；速效鉀含量的測定采用醋酸銨浸提-火焰光度計法；全氮含量的測定采用納氏比色法；全磷含量的測定采用鉬銻抗比色法；全鉀含量的測定采用火焰光度計法；有機質(zhì)含量的測定采用高溫外熱重鉻酸鉀氧化—容量法。

1.3.2土壤總DNA提取及基因擴增 采用OMEGA試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取豆科栽培牧草根際土壤樣品中的微生物DNA基因組，每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)，以降低DNA提取過程中的操作誤差，采用Illumina HiSeq PE250測序平臺的通用引物(341F和805R)對細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴增，擴增體系參照趙帆等[22]的方法，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合適后，送至生工生物工程股份有限公司(上海)，在Illumina HiSeq PE250測序平臺，利用雙末端測序的方法對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析[23]。

1.4 生物信息學(xué)分析

根據(jù)Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后對Reads進(jìn)行拼接[24]得到原始Tags數(shù)據(jù)(Raw Tags)；對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和去除嵌合體序列，最終得到有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)；使用Qiime軟件對Tags在97%的相似度水平下進(jìn)行OTUs聚類，用Mothur[25]方法與SILVA軟件的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋(閾值0.8～1.0)；采用PyNAST軟件[26]與GreenGene數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)信息進(jìn)行多序列比對，最后對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用Qiime1.7.0軟件進(jìn)一步進(jìn)行α多樣性分析、β多樣性分析和顯著物種差異分析等，采用使R軟件(2.15.3)繪制稀釋曲線。通過R語言工具繪制熱圖，采用非加權(quán)配對平均法進(jìn)行層次聚類繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel 2013處理，采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(P<0.05)。土壤因子與細(xì)菌種群分布特征之間的關(guān)系，采用Pearson相關(guān)系數(shù)法進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

4種不同豆科栽培牧草根際土壤理化性特征測定結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明4種豆科栽培牧草根際土壤的pH值在8.02～8.25之間，樣品TDB和TDH間pH值差異顯著(P<0.05)，全氮含量變化范圍為1.10～2.79 g·kg-1，全磷含量范圍在1.96～3.44 g·kg-1之間，全鉀含量范圍為23.85～24.81 g·kg-1，樣品TDC與其他樣品的土壤全鉀含量差異顯著(P<0.05)，速效氮含量范圍為78.00～187.00 mg·kg-1，速效磷含量范圍為19.30～75.20 mg·kg-1，速效鉀含量范圍為78.00～168.00 mg·kg-1，有機質(zhì)含量范圍為16.39～41.73 g·kg-1。TDB樣地的全氮、全磷、速效氮、速效磷、速效鉀及有機質(zhì)含量顯著低于其他樣地(P<0.05)，TDC樣地的全磷、全鉀含量顯著高于其他樣地(P<0.05)。

表1 土壤理化性質(zhì)特征

2.2 土壤細(xì)菌群落豐度與Alpha多樣性分析

通過Illumina HiSeq PE250高通量測序技術(shù)，共得到有效序列234 099條，序列長度相對集中，平均長度分別為413 bp，418 bp，418 bp，417 bp，聚類共得到5 707個OTUs。樣本文庫的覆蓋度均在99.5%以上，結(jié)合圖2平緩的樣品稀釋曲線，可知該測序數(shù)據(jù)合理，能夠充分反映出土壤細(xì)菌群落的真實信息。4種豆科栽培牧草根際土壤細(xì)菌群落豐富度指數(shù)(Chao1和ACE指數(shù))依次為TDC>TDH>TDZ>TDB(表2)；細(xì)菌群落多樣性指數(shù)中Simpson指數(shù)依次為TDB>TDH=TDC>TDZ；Shannon指數(shù)依次為TDZ>TDC>TDH>TDB。在97%的相似度水平下，得到了每個樣品的OTU個數(shù)，如Venn圖(圖3)所示，所有樣品中共有OTUs數(shù)目為696個，其中TDB，TDC，TDH，TDZ所特有的OTUs數(shù)目分別為26，62，16和16個。

圖2 樣品稀釋曲線

圖3 樣品韋恩圖

表2 樣品序列數(shù)統(tǒng)計、豐富度與多樣性指數(shù)

2.3 土壤細(xì)菌群落分布特征

2.3.1門水平上的組成 通過測序發(fā)現(xiàn)，4種豆科栽培牧草根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門水平上具有較高的多樣性(圖4)，各樣品土壤細(xì)菌分屬于25個門，相對豐度>1%的菌門為：變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、Saccharibacteria、浮霉菌門(Planctomycetes)。通過對4種栽培牧草根際土壤細(xì)菌各門所占比例分析發(fā)現(xiàn)，各樣品在門分類水平上的菌群落豐度存在一定的差異。其中變形菌門最為豐富，在TDB，TDC，TDH，TDZ樣品中的相對豐度分別為58.14%，35.83%，45.40%，38.15%。擬桿菌門在TDH樣品中相對豐度較高，為22.49%，顯著高于其他3個樣品(P<0.05)。放線菌門在TDC樣地中的相對豐度(為19.56%)顯著優(yōu)于其他3個樣品(P<0.05)。

2.3.2屬水平上的組成 在屬分類水平上，4種豆科栽培牧草根際土壤細(xì)菌分屬于291個屬，相對豐度>1%的細(xì)菌類群如圖5所示，分別為鞘氨醇單包菌屬(Sphingomonas)，新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium)，不可培養(yǎng)芽單孢菌屬(uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae)，土地桿菌屬(Pedobacter)，Pseudarthrobacter，黃桿菌屬(Flavobacterium)，不可培養(yǎng)亞硝化單胞菌屬(uncultured_bacterium_f_Nitrosomonadaceae)，不可培養(yǎng)酸微菌屬(uncultured_bacterium_o_Acidimicrobiales)，不可培養(yǎng)Subgroup(uncultured_bacterium_f_Blastocatellaceae_[Subgroup_4])，根瘤菌屬(Rhizobium)。其中新鞘氨醇桿菌屬在TDB樣地土壤細(xì)菌中為優(yōu)勢類群，相對豐度為31.01%，鞘氨醇單包菌屬在TDC，TDH，TDZ樣品中相對豐度較高，顯著高于其他細(xì)菌類群，相對豐度分別為14.96%，9.25%，11.53%，4種豆科栽培牧草根際土壤細(xì)菌土壤在屬分類水平上，相對豐度存在顯著差異(P<0.05)。

圖4 門分類水平下的細(xì)菌群落相對豐度

圖5 屬分類水平下的細(xì)菌群落相對豐度

2.4 Beta多樣性分析

選用非度量多維標(biāo)定NMDS分析法來衡量4個樣品間的相異系數(shù)。圖6中點分別表示各樣品，不同顏色代表不同分組，各點之間的距離表示差異程度，當(dāng)Stress小于0.2時，表明NMDS分析具有一定的可靠性，在坐標(biāo)圖上距離越近的樣品，相似性越高。由圖6可知，4種不同豆科栽培牧草根際土壤樣品，TDH和TDZ之間點距離較近，說明紅豆草和紫花苜蓿根際土壤的細(xì)菌群落構(gòu)成相似，而樣品TDB和TDH，TDZ，TDC 3個樣品之間點距離較遠(yuǎn)，說明扁蓿豆牧草根際土壤和另外3種豆科牧草根際土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。通過對各樣品在屬分類水上進(jìn)行加權(quán)Unifrac距離的UPGMA(Unweighted pair-group method with arithmetic mean)聚類分析(圖7)，TDH與TDZ樣地間細(xì)菌群落組成及豐度相似性較高，與TDB樣地間細(xì)菌群落組成差異性較大。

圖6 NMDS分析圖

2.5 土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌優(yōu)勢類群的相關(guān)性

對門水平豐度較高物種與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析(表3)表明：土壤pH與變形菌門、放線菌門、Saccharibacteria豐度呈正相關(guān)關(guān)系，與其他細(xì)菌類群豐度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。土壤全氮、全磷、速效磷、有機質(zhì)含量與酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、疣微菌門、硝化螺旋菌門、浮霉菌門豐度呈正相關(guān)關(guān)系，與Saccharibacteria豐度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與變形菌門、擬桿菌門、放線菌門呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。土壤全鉀含量與酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、硝化螺旋菌門、浮霉菌門豐度呈正相關(guān)關(guān)系，與變形菌門、擬桿菌門、疣微菌門、Saccharibacteria豐度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。土壤速效氮、速效鉀含量與擬桿菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、疣微菌門、硝化螺旋菌門、浮霉菌門豐度呈正相關(guān)關(guān)系，與變形菌門、放線菌門、Saccharibacteria豐度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖7 屬水平上物種組成的UPGMA聚類樹圖

2.6 土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌多樣性的相關(guān)性

對4種豆科栽培牧草根際土壤細(xì)菌群落多樣性與土壤理化性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明(表4)，土壤細(xì)菌群落豐富度Chao1指數(shù)與土壤全磷含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與土壤全氮、速效磷、有機質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Shannon與土壤速效磷含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與全氮、全磷、全鉀、速效氮、速效鉀、有機質(zhì)含量呈正相關(guān)關(guān)系。

表3 門水平物種與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

表4 不同豆科栽培牧草根際土壤細(xì)菌群落多樣性與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

3 討論

草地土壤生物在草地生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)著重要的部分，土壤微生物在土壤生化過程中幾乎推動著所有的反應(yīng)，對生態(tài)系統(tǒng)的功能有著重要意義[27-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，同一地區(qū)的不同豆科牧草根際土壤微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)及其變化規(guī)律存在顯著性差異。本研究Alpha多樣性分析結(jié)果表明，細(xì)菌群落Chao1指數(shù)依次為TDC>TDH>TDZ>TDB；細(xì)菌群落Shannon指數(shù)依次為TDZ>TDC>TDH>TDB。β多樣性分析結(jié)果表明，TDH與TDZ間的細(xì)菌多樣性相似度較高，與TDB樣地差異性較大。形成此差異的主要因素可能與牧草品種、根系分泌物和土壤理化性質(zhì)等因子有關(guān)[30]。有研究表明蠶豆根系發(fā)達(dá)，豐富的地上生物量所需的養(yǎng)分比其他3種較多，足夠的分泌物能夠促進(jìn)微生物群落的生長[31]。有學(xué)者研究證實，不同植物根際微生物多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)存在明顯差異[21-34]，這與本研究結(jié)果一致。

陳孟立等[35]對黃土丘陵區(qū)退耕還林還草對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌主要有變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門，這與本研究在門水平上的細(xì)菌群落組成所得的結(jié)果相似，但細(xì)菌群落組成豐度存在差異，在本研究中，相對豐度較高的細(xì)菌菌門為變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門和綠彎菌門。劉洋等[36]通過對黃土高原不同植被類型下土壤細(xì)菌群落特征研究發(fā)現(xiàn)，該研究區(qū)土壤中的優(yōu)勢菌門為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌、浮霉菌門，并且驗證了變形菌門為堿性土壤中的主要優(yōu)勢菌群，這與本研究結(jié)果一致。酸桿菌門一般存在于營養(yǎng)比較匱乏的環(huán)境，放線菌門能夠降解纖維素和幾丁質(zhì)，是土壤養(yǎng)分供給的主要來源，并且產(chǎn)生的孢子能夠抵抗外界不利的環(huán)境條件，使得它成為高寒草地土壤的優(yōu)勢菌群[37]。綠彎菌門是一類通過光合作用產(chǎn)生能量的細(xì)菌，高寒地區(qū)常年光照時間長，特殊的地理位置為綠彎菌等微生物的繁殖和生長創(chuàng)造了有利的條件[38]。許多學(xué)者研究證實[39-41]，土壤微生物與土壤環(huán)境因子進(jìn)行復(fù)雜的相互作用，并且存在密切的聯(lián)系，本研究采用不同種豆科栽培牧草在同一地區(qū)且相同栽培管理條件下，細(xì)菌群落組成及相對豐度差異顯著，根際土壤理化性質(zhì)間也存在顯著性差異。通過土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌優(yōu)勢類群、細(xì)菌多樣性的相關(guān)性分析表明，4種豆科栽培牧草根際土壤細(xì)菌群落多樣性與土壤全磷、速效磷、全氮、全鉀、速效氮、速效鉀、有機質(zhì)的含量及土壤pH間存在一定的相關(guān)性，其中土壤全氮、全磷、速效磷和有機質(zhì)可能是主要驅(qū)動因素。李海云等[42]發(fā)現(xiàn)東祁連山退化高寒草地土壤細(xì)菌種群數(shù)量的變化主要受土壤環(huán)境因子的影響，如pH、電導(dǎo)率、速效氮、速效鉀等。汪焱等[43]的研究結(jié)果表示，燕麥根際土壤微生物群落多樣性與土壤的理化性質(zhì)間存在顯著相關(guān)關(guān)系，其中主要的驅(qū)動因素是土壤pH、全磷、速效磷含量。朱瑞芬等[44]研究表明，土壤pH、土壤有機質(zhì)與羊草根際土壤細(xì)菌多樣性呈顯著正相關(guān)。Peng等[45]在次生演替林經(jīng)歷土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤有機質(zhì)的緊密耦合變化研究中揭示了土壤有機質(zhì)數(shù)量以及質(zhì)量是驅(qū)動土壤微生物群落結(jié)構(gòu)構(gòu)建的主要因素，這與本次研究結(jié)果一致。土壤pH被廣泛認(rèn)為是全球微生物多樣性和豐富度的最佳預(yù)測因子[46-47]，然而，在本次研究中，細(xì)菌物種的豐富度和多樣性并沒有與土壤pH呈顯著的相關(guān)性，這可能是由于本研究觀察到的pH范圍較窄(8.02～8.25)。草地土壤微生物群落分布直接影響了植物的健康情況，因此，探究植物根際土壤微生物和土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系為今后維持高寒草地生態(tài)系統(tǒng)和發(fā)展畜牧業(yè)奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明同一地區(qū)種植的4種豆科栽培牧草根際土壤理化性質(zhì)存在顯著差異，根際土壤的細(xì)菌群落組成豐度較高，但同一地區(qū)種植的4種豆科栽培牧草根際土壤微生物種群結(jié)構(gòu)具有一定的差異性。通過高通量測序技術(shù)，共得到有效序列234 099條，聚類共得到5 707個OTUs；土壤細(xì)菌群落豐富度指數(shù)表現(xiàn)為蠶豆>紅豆草>紫花苜蓿>扁蓿豆；多樣性指數(shù)表現(xiàn)為紫花苜蓿>蠶豆>紅豆草>扁蓿豆；在門分類水平上，細(xì)菌群落中變形菌門是最優(yōu)勢菌群；Beta多樣性分析表明，紅豆草樣地與紫花苜蓿樣地間的細(xì)菌多樣性相似度較高，與扁蓿豆樣地差異性較大；通過相關(guān)性分析，高寒地區(qū)不同豆科牧草根際土壤細(xì)菌群落多樣性與土壤理化性質(zhì)存在顯著相關(guān)關(guān)系，其中土壤全氮、全磷、速效磷和有機質(zhì)可能是主要的驅(qū)動因子。