張玉霞， 叢百明， 王顯國(guó)， 張慶昕， 杜曉艷， 田永雷

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)， 內(nèi)蒙古 通遼 028041；2.內(nèi)蒙古通遼市農(nóng)牧業(yè)局，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 北京 100083；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010013)

苜蓿作為優(yōu)質(zhì)的多年生豆科牧草(Leguminosaesp.)[1]，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用[2]。越冬問(wèn)題雖然是長(zhǎng)期困擾苜蓿生產(chǎn)的老問(wèn)題，但由于近幾年我國(guó)北方苜蓿種植面積不斷擴(kuò)大，苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，越冬問(wèn)題已成為制約我國(guó)北方苜蓿草地成功建植和草地可持續(xù)利用的關(guān)鍵問(wèn)題。由于科爾沁沙地冬季積雪少，土壤溫度變化劇烈，凍害頻發(fā)，嚴(yán)重制約了該地區(qū)苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3]。因此，進(jìn)一步探究苜蓿的越冬機(jī)制，以增加苜蓿防御凍害的能力，提高其越冬率，重新認(rèn)識(shí)苜?？购詥?wèn)題是必要的。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于苜?？购矫娴难芯勘砻?，苜蓿越冬器官的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化物酶(Peroxidase，POD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)是酶促防御系統(tǒng)的重要保護(hù)酶類，對(duì)于維護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有重要作用[4-6]，其活性的變化可作為植物的耐寒指標(biāo)[7-9]，但具體什么時(shí)期或在怎樣溫度條件下進(jìn)行鑒定尚不明確。目前衡量苜?？购灾饕笜?biāo)有大田越冬率調(diào)查和室內(nèi)模擬半致死溫度(LT50)，LT50采用模擬低溫處理通過(guò)測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率或根系活力擬合Logistic方程獲得，能夠避開(kāi)生態(tài)因子對(duì)苜?？购缘挠绊慬10]。為此，本試驗(yàn)于越冬前期挖取科爾沁沙地生境下種植的黃花苜蓿(MedicagofalcataL.)和4個(gè)紫花苜蓿(Medicagosativa)品種的越冬器官，在程序式溫度處理箱模擬低溫處理，測(cè)定不同溫度處理下抗氧化酶活性和相對(duì)電導(dǎo)率的變化，利用相對(duì)電導(dǎo)率擬合Logistic方程得出LT50，通過(guò)LT50與抗氧化酶活性變化的相關(guān)性分析，分析苜蓿的抗寒性差異及其與抗氧化酶的相關(guān)性，為苜?？购贩N的篩選及抗氧化機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

苜蓿材料來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 苜蓿材料名稱及來(lái)源

1.2 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于內(nèi)蒙古民族大學(xué)科技園區(qū)，地理位置為43°30′ N，122°27 E，年平均氣溫5.5℃，≥10℃年積溫為3 000～3 200℃，無(wú)霜期140～150 d，年平均降水量約375 mm，年平均風(fēng)速3.0～4.4 m·s-1，土壤為沙壤土，pH值為8.0，土壤有機(jī)質(zhì)含量0.65%，堿解氮36.37 mg·kg-1，速效磷含量3.81 mg·kg-1，速效鉀含量78.51 mg·kg-1，全氮含量0.037%。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在科爾沁沙地的沙化草地生境下，于2019年7月15日種植黃花苜蓿和‘騎士T’、‘巨能3010’、‘草原3號(hào)’、‘北極熊’紫花苜蓿，播種量15 kg·hm-2，條播行距15 cm，小區(qū)面積(2 m×5 m)，3次重復(fù)，四周設(shè)保護(hù)行。灌溉方式為指針式噴灌，肥料在播種時(shí)一次性施入，氮磷鉀施肥量分別為45 kg·hm-2(純氮)、200 kg·hm-2(P2O5)、200 kg·hm-2(K2O)，供試肥料分別為尿素(N 46.3%)、重過(guò)磷酸鈣(P2O544.6%)、鉀肥為氯化鉀(K2O 60%)。2019年11月15日(封凍前期)每個(gè)小區(qū)隨機(jī)挖取50株長(zhǎng)勢(shì)均勻的苜蓿越冬器官，4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。每個(gè)處理分別取20株于程序式低溫處理箱采用-10，-15，-20，-25和-30℃模擬低溫處理，以0℃為起點(diǎn)，4℃·h-1的速率降溫，到達(dá)設(shè)定溫度后保持6 h，然后再按照4℃·h-1速率升溫至4℃，在冰箱4℃下保存12 h，以低溫(4℃)貯藏為對(duì)照(CK)，測(cè)定抗氧化酶活性和相對(duì)電導(dǎo)率，并依據(jù)測(cè)定其相對(duì)電導(dǎo)率擬合Logistic方程，計(jì)算半致死溫度。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

采用DDS-302電導(dǎo)率儀測(cè)定電導(dǎo)率并計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率[11]；采用NBT光還原法測(cè)定SOD活性[11]；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性[12]；采用紫外吸收法測(cè)定CAT活性[11]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel軟件處理、做圖和制作表格，SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差顯著性分析及擬合Logistic方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下苜蓿相對(duì)電導(dǎo)率的變化及LT50

如表2所示，隨著脅迫溫度的降低，苜蓿根頸的相對(duì)電導(dǎo)率呈增加趨勢(shì)，其中‘騎士T’、‘巨能3010’、‘草原3號(hào)’和‘北極熊’等紫花苜蓿品種根頸的相對(duì)電導(dǎo)率則在-15℃低溫處理開(kāi)始顯著增加(P<0.05)；黃花苜蓿的相對(duì)電導(dǎo)率則在-20℃低溫處理開(kāi)始顯著增加(P<0.05)。在CK和-10℃低溫處理下不同苜蓿之間的相對(duì)電導(dǎo)率無(wú)顯著差異，-15℃低溫處理下黃花苜蓿根頸相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于‘巨能3010’和‘北極熊’(P<0.05)，-20℃處理下黃花苜蓿和‘北極熊’相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于‘騎士T’和‘巨能3010’(P<0.05)，-25℃和-30℃低溫處理下黃花苜蓿根頸的相對(duì)電導(dǎo)率則分別顯著低于‘騎士T’和‘巨能3010’(P<0.05)。根據(jù)苜蓿根頸相對(duì)電導(dǎo)率結(jié)合Logistic回歸分析，計(jì)算半數(shù)致死溫度，黃花苜蓿的抗寒性強(qiáng)于紫花苜蓿，4個(gè)紫花苜蓿品種的抗寒性為‘北極熊’>‘草原3號(hào)’>‘巨能3010’>‘騎士T’。

2.2 低溫脅迫下不同苜蓿根頸SOD活性的變化

由表3可知，在不同低溫處理下，‘騎士T’、‘巨能3010’、‘草原3號(hào)’苜蓿根頸的SOD活性呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，且均在-25℃低溫處理下苜蓿根頸的SOD活性最強(qiáng)，與—30℃處理差異不顯著?！睒O熊’和黃花苜蓿根頸SOD活性則隨著處理溫度的降低呈不斷增加趨勢(shì)，其中‘騎士T’和黃花苜蓿則在-20℃處理下開(kāi)始顯著增加，‘巨能3010’、‘草原3號(hào)’和‘北極熊’在-25℃處理開(kāi)始顯著增加。-20℃低溫處理下黃花苜蓿根頸SOD活性顯著高于‘巨能3010’(P<0.05)，-25℃處理下黃花苜蓿根頸SOD活性顯著高于‘騎士T’(P<0.05)?！?0℃處理下黃花苜蓿的SOD活性顯著高于‘騎士T’、‘巨能3010’、‘草原3號(hào)’。因此-25℃和-30℃低溫處理下苜蓿根頸的SOD酶活性可以作為鑒定苜蓿抗寒性的生理指標(biāo)。

表2 低溫脅迫下苜蓿根頸相對(duì)電導(dǎo)率(%)的變化及LT50值(℃)

表3 低溫脅迫下苜蓿根頸SOD活性的變化

2.3 低溫脅迫下不同苜蓿根頸POD的變化

由表4可知，黃花苜蓿和4個(gè)紫花苜蓿品種在低溫脅迫下根頸POD活性均呈先升高再降低的趨勢(shì)?！T士T’苜蓿根頸的POD活性在-15℃處理下最高，顯著高于對(duì)照和-30℃處理(P<0.05)，‘巨能3010’苜蓿根頸的POD活性在-20℃處理下最高，顯著高于其他溫度處理(P<0.05)，‘草原3號(hào)’、‘北極熊’和黃花苜蓿根頸的POD活性在-25℃處理下最高，顯著高于其他溫度處理(P<0.05)。-20℃，-25℃，-30℃低溫處理下黃花苜蓿根頸的POD活性顯著高于4個(gè)紫花苜蓿品種(P<0.05)。由此說(shuō)明，抗寒性強(qiáng)的苜蓿材料POD活性增強(qiáng)溫度較低，且活性較強(qiáng)。

表4 低溫脅迫下苜蓿根頸POD活性的變化

2.4 低溫脅迫下不同苜蓿根頸CAT的變化

由表5可知，黃花苜蓿和4個(gè)紫花苜蓿品種根頸CAT活性隨脅迫溫度的降低呈先降低再升高的變化趨勢(shì)。-10℃低溫處理下‘草原3號(hào)’根頸CAT活性顯著低于其他溫度處理(P<0.05)，黃花苜蓿和其他3個(gè)紫花苜蓿品種在-20℃低溫處理下根頸CAT活性最顯著低于-30℃低溫處理(P<0.05)。-15℃和-20℃低溫處理下‘草原3號(hào)’根頸CAT活性顯著高于黃花苜蓿和其他3個(gè)紫花苜蓿品種(P<0.05)，-25℃低溫處理下黃花苜蓿根頸的CAT活性顯著高于‘騎士T’、‘巨能3010’、‘北極熊’，-30℃低溫處理下黃花苜蓿根頸CAT活性顯著高于4個(gè)紫花苜蓿品種(P<0.05)。說(shuō)明‘草原3號(hào)’和黃花苜蓿通過(guò)增強(qiáng)CAT活性提高苜蓿的抗寒能力。

表5 低溫脅迫下苜蓿根頸CAT活性的變化

2.5 低溫脅迫下苜蓿根頸抗氧化酶活性與LT50的相關(guān)性分析

由表6可知，不同低溫脅迫下苜蓿的抗氧化酶活性均與LT50呈負(fù)相關(guān)，—30℃低溫處理下苜蓿根頸SOD和CAT活性與其LT50的相關(guān)性達(dá)到顯著(P<0.05)和極顯著水平(P<0.01)，說(shuō)明—30℃低溫脅迫下SOD活性和CAT活性可以作為判斷苜?？购詮?qiáng)弱的敏感指標(biāo)。

表6 半致死溫度與苜蓿根頸中抗氧化酶活性的相關(guān)性

3 討論

關(guān)于苜?？购缘难芯恐饕捎锰镩g自然低溫脅迫處理的方法[7]，通過(guò)測(cè)定翌年的越冬率衡量苜?？购缘膹?qiáng)弱，抗寒生理指標(biāo)則采用越冬期不同低溫處理時(shí)期取樣測(cè)定，這種方法容易受外界氣候和土壤環(huán)境影響，冬季取樣困難。近些年開(kāi)始采用程序式試驗(yàn)箱人工模擬低溫處理方法[13]，利用半致死溫度衡量苜蓿的抗寒性，這種方法能夠避開(kāi)其他環(huán)境因素的影響，取樣測(cè)定抗寒生理指標(biāo)簡(jiǎn)便易行。本研究則通過(guò)大田培養(yǎng)苜蓿材料，采用人工模擬低溫處理方法，獲得半致死溫度判定苜?？购圆町?。結(jié)果表明，黃花苜蓿的抗寒性強(qiáng)于紫花苜蓿，4個(gè)紫花苜蓿品種的抗寒性為‘北極熊’>‘草原3號(hào)’>‘巨能3010’>‘騎士T’。

POD在保護(hù)酶系統(tǒng)中主要是降解過(guò)氧化物的作用[14]，關(guān)于POD活性在低溫脅迫下的變化規(guī)律，申曉慧研究田間自然低溫脅迫下POD活性的變化，表明隨著氣溫的下降而上升，進(jìn)入深冬又下降，翌年春季氣溫回升后，又有所回升[7]；崔國(guó)文研究表明，POD活性都表現(xiàn)為隨著秋末溫度的下降而增加，隨著寒冷的加劇而迅速下降，再隨著翌年溫度的回升而緩慢增加，但POD活性與品種抗寒力不呈正相關(guān)關(guān)系[15]。馮昌軍研究表明，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，POD活性呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，抗寒性強(qiáng)的苜蓿品種維持較高的POD酶活性[16]。本研究采用人工模擬低溫處理方法研究苜蓿根頸的POD變化規(guī)律，結(jié)果表明，隨著脅迫溫度的降低，苜蓿根頸的POD活性呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，與申曉慧[7]、崔國(guó)文[15]、馮昌軍[16]的研究結(jié)果一致，但與崔國(guó)文研究不同的是，苜蓿根頸的POD活性與苜蓿的抗寒性呈正相關(guān)，這與南麗麗[17]、申曉慧[7]、朱愛(ài)民[18]的研究結(jié)果一致，通過(guò)與苜?？购缘南嚓P(guān)性分析表明，苜蓿根頸的POD活性與苜?？购缘南嚓P(guān)性不顯著，因此POD活性不能作為鑒定苜?？购缘纳碇笜?biāo)。

CAT具有將低溫脅迫下產(chǎn)生的H2O2分解成水的作用[19]。關(guān)于低溫脅迫下苜蓿根頸CAT活性的變化規(guī)律研究較少，楊秀娟采用田間自然低溫脅迫處理研究，表明2個(gè)紫花苜蓿品種根頸中CAT活性均隨著溫度的降低而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在初冬時(shí)達(dá)到最大值，進(jìn)入深冬，則有不同程度的波動(dòng)，且活性下降明顯[20]。本研究采用模擬低溫脅迫處理，研究苜蓿根頸CAT活性的變化，與其結(jié)果不同，隨著冷凍脅迫溫度的降低，苜蓿的CAT活性呈增加的變化趨勢(shì)，在—30℃低溫脅迫下黃花苜蓿和4個(gè)紫花苜蓿品種根頸的CAT活性最強(qiáng)，相關(guān)性分析表明，在-10℃和—30℃低溫處理下苜蓿根頸的CAT活性與苜蓿的抗寒性呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明-10℃和—30℃低溫處理下苜蓿根頸的CAT活性都可以作為苜?？购缘蔫b定指標(biāo)。

4 結(jié)論

科爾沁沙化草地種植的苜蓿抗寒性為黃花苜蓿強(qiáng)于紫花苜蓿，4個(gè)紫花苜蓿品種的抗寒性為‘北極熊’>‘草原3號(hào)’>‘巨能3010’>‘騎士T’。LT50與不同低溫脅迫下抗氧化酶活性相關(guān)性分析表明，—30℃低溫處理下SOD活性和CAT活性以及-10℃低溫處理下的CAT活性可以作為苜?？购b定的敏感指標(biāo)。