許 超， 何承剛， 牟 蘭， 畢玉芬*， 姜 華*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 云南 昆明 650201； 2. 昆明市農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校， 云南 昆明 650032)

隨著全球氣候進(jìn)一步變暖[1]，高溫和干旱嚴(yán)重影響著植物的光合作用，而且這兩種非生物脅迫通常同時(shí)發(fā)生，對(duì)植物的影響比單因素脅迫更大，尤其是在半干旱或干旱地區(qū)[2]。植物的光合作用和生長(zhǎng)通常受到二氧化碳固定酶—核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)活性的限制[3-4]，Rubisco活化酶(Rubisco activase,RCA)則是調(diào)節(jié)Rubisco活性的關(guān)鍵酶，通過(guò)改善RCA酶的活性可提高Rubisco的性能，是顯著提高植物產(chǎn)量的一條可行途徑[5-7]。Ristic等[8]的研究表明內(nèi)源RCA在植物生產(chǎn)水平中發(fā)揮重要作用。Rubisco羧化和氧化的過(guò)程是RCA酶固有的滯后性引起的，在早期的研究中發(fā)現(xiàn)RCA(激活因子)通過(guò)與Rubisco大亞基(rbcL) 結(jié)合而發(fā)揮功能[9]。王保明等[10]從油茶(Camelliaoleifera)葉片中成功克隆了CorbcL基因，并證明其轉(zhuǎn)錄表達(dá)與油茶油產(chǎn)量及種子產(chǎn)量之間具有一定的相關(guān)性。Laura等研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自類(lèi)球紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)中的RCA活化酶RsRca能顯著提升RsRubisco的活性，并使煙草的光合效率和生長(zhǎng)提升2倍[4]，因此，Rubisco被作為增強(qiáng)光合作用和提高生產(chǎn)力的首要研究目標(biāo)。

盡管人們對(duì)各種植物在干旱和高溫脅迫下的影響進(jìn)行了廣泛的研究，如干熱條件對(duì)地中海葡萄(Vitisvinifera)[11]、小扁豆(Lensculinaris)[12]、小麥(Triticumaestivum)[13]的生理響應(yīng)，但在干熱脅迫下對(duì)紫花苜蓿(Medicagosativa)的研究主要集中在葉片氣孔大小、生理特性、光合特性和引種[14-17]等方面。另外，有學(xué)者研究了紫花苜蓿的耐鹽基因[18-19]、抗逆基因[20]，但關(guān)于干熱脅迫下紫花苜蓿Rubisco大亞基rbcL和RCA的基因rca結(jié)構(gòu)和功能的研究在國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。因此，本研究以云南野生紫花苜蓿和‘阿爾岡金’紫花苜蓿為試驗(yàn)材料，研究在干熱脅迫條件下光合關(guān)鍵酶Rubisco羧化酶及RCA活性變化及其基因表達(dá)情況，以期為深入探討紫花苜蓿該基因的結(jié)構(gòu)與功能、進(jìn)一步利用野生紫花苜蓿種質(zhì)資源提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用野生紫花苜蓿和‘阿爾岡金’紫花苜蓿作為試驗(yàn)材料，其中野生紫花苜蓿采自云南省迪慶州德欽縣奔子欄鄉(xiāng)的干熱河谷地區(qū)，‘阿爾岡金’紫花苜蓿引自加拿大，有較強(qiáng)的抗逆性，種子由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)草學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)草學(xué)試驗(yàn)基地溫室及實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。選取飽滿均勻的紫花苜蓿種子，每盆播種20～30粒，當(dāng)植株長(zhǎng)出3～4片真葉時(shí)，取葉片保存在-80℃條件下，用于目的基因序列擴(kuò)增。待植株生長(zhǎng)至150 d時(shí)，隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的每種材料各3盆，每盆10 株，置于人工氣候箱進(jìn)行干熱脅迫處理，設(shè)定空氣濕度為30%，白天(14 h)溫度為32℃，夜間(10 h)溫度為28℃。于干熱處理前(對(duì)照)及干熱脅迫處理后第4 d，8 d，12 d和復(fù)水(恢復(fù)為處理前的溫度和濕度，且少量多次澆水至盆底溢水為止)后4 d，分別選取相同葉位的成熟葉片，經(jīng)液氮處理后在-80℃條件下保存，用于測(cè)定干熱脅迫下紫花苜蓿的Rubisco的活性及相關(guān)基因的表達(dá)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1Rubisco活性 酶液提取和活性測(cè)定方法參照Tsuyoshi等[21]。(1)粗酶液制備：稱取新鮮葉片0.25 g，加液氮研磨，加入4 mL遇冷的提取液(50 mmol·L-1Tris-HCl,pH 7.8,0.01% (v/v) Triton X-100,1 mmol·L-1EDTA,10 mmol·L-1DTT,10 mmol·L-1MgCl2)，冰浴研磨至勻漿，4℃離心(×15 000 g)15 min，取上清液備用。(2)Rubisco活性測(cè)定[22]：反應(yīng)體系：5 mmol·L-1NADH 0.1 mL，50 mmol·L-1ATP 0.1 mL，0.2 mol·L-1NaHCO30.1 mL，0.7 mL反應(yīng)介質(zhì)[100 mmol·L-1Tris-HCl，內(nèi)含12 mmol·L-1MgCl2和0.4 mmol·L-1EDTA·Na2(pH7.8)]，160 U·mL-1肌酸磷酸激酶0.05 mL，160 U·mL-1甘油酸磷酸肌酶0.05 mL，160 U·mL-1甘油醛磷酸脫氫酶0.05 mL，蒸餾水0.15 mL。反應(yīng)體系搖勻，倒入比色杯內(nèi)，加入紫花苜蓿RuBPCase 0.1 mL，馬上計(jì)時(shí)，每隔30 s測(cè)一次吸光度，測(cè)3 min。以每分鐘內(nèi)OD340 nm吸光度下降的絕對(duì)值計(jì)算酶活力。(3)酶活性計(jì)算：RuBPCase酶活力=(△A × V)/(2×d×6.22×△t×V酶)，△A為反應(yīng) 3 min內(nèi) 340 nm處吸光度變化的絕對(duì)值，V為反應(yīng)體系總體積，d (cm)為比色光程，6.22為每微摩爾NADH在340 nm處的吸光度，2表示每固定1 mol CO2有2 mol NADH被氧化，△t為測(cè)定時(shí)間，V酶為酶液體積，活性單位表示為mmol·mg-1·min-1。

1.3.2RCA活性 稱取鮮葉200 mg加液氮研磨，倒入2 mL預(yù)冷的離心管，加入預(yù)冷的GENMED裂解液500 μL，渦旋震蕩5 s使其充分混勻，4℃離心5 min，轉(zhuǎn)速為300 g，取上清液500 μL至1.5 mL離心管，4℃離心10 min，轉(zhuǎn)速為1 000 g。棄上清液，加入200 μL GENMED裂解液，混勻待測(cè)。移取10 μL混勻液進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)，具體步驟及計(jì)算方法參見(jiàn)GENMED bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1說(shuō)明書(shū)。

1.3.3紫花苜蓿的rbcL和rca基因的序列擴(kuò)增 取紫花苜蓿葉片，采用改良CTAB法[23]提取DNA，對(duì)2種紫花苜蓿的rbcL和rca基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，rbcL基因擴(kuò)增的引物[24]為：上游引物5′-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3′，下游引物5′- GAAACGGTCTCTCCAACGCAT-3′；rca基因擴(kuò)增的引物[25]為：上游引物5′-GTGTGGCCTCCTATTGGCA-3′,下游引物5′-CTCGGTCTCAAATTCCAG-3′。測(cè)序后經(jīng)NCBI內(nèi)進(jìn)行Blast比對(duì)，確定基因的同源性，再用DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行序列比較，明確該基因的序列特征。引物的合成與測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)測(cè)定rbcL和rca基因的相對(duì)表達(dá)量 以18S為內(nèi)參基因，取紫花苜蓿葉片，使用RNA提取試劑盒(華越洋公司)提取總RNA，采用RS232C BioPhotometer核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定OD260/280檢測(cè)其純度，利用試劑盒(AMV First Strand cDNA Synthesis Kit)反轉(zhuǎn)錄第一條cDNA鏈。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL體系：SYBR Green qPCR Master Mix (2X) 10 μL，上下游引物(10umol·L-1)各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL，在北京羅氏PCR儀(LightCycler 480)中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，95℃ 15 s，60℃ 40 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品3次技術(shù)重復(fù)，基因相對(duì)表達(dá)量采用2-△△CT方法計(jì)算[26]。以18S基因作為內(nèi)參基因，上游引物 5′-TTCTTAGTTGGTGGAGCG-ATTT-3′,下游引物5′-CCTGTTATTGCCTCAAACTTCC-3′，目的基因引物同1.3.3。

1.4 數(shù)據(jù)處理

同一供試材料、不同處理各項(xiàng)指標(biāo)之間的差異顯著(P<0.05)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，相同處理?xiàng)l件下不同供試材料之間顯著性差異(P<0.05和P<0.01)采用Tukey檢驗(yàn)，差異性分析和相關(guān)性分析均利用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件(IBM,NY，USA)完成。作圖采用Sigma Plot 10.0 軟件(Systat Software,Inc.,Richmond,CA,USA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干熱脅迫對(duì)紫花苜蓿的Rubisco羧化酶和RCA酶活性的影響

如圖1所示，隨干熱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，2種紫花苜蓿葉片Rubisco活性呈現(xiàn)先顯著下降后顯著上升趨勢(shì)，且在干熱脅迫的第8 d達(dá)到最低值，此時(shí)野生紫花苜蓿的Rubisco活性較脅迫前顯著降低了47.49%(P<0.05)，‘阿爾岡金’則較脅迫前顯著降低了50.00%(P<0.05)；2種紫花苜蓿葉片Rubisco活性在復(fù)水4 d后比脅迫結(jié)束時(shí)顯著升高，但仍顯著低于干熱脅迫前；各處理中野生紫花苜蓿的Rubisco活性都極顯著高于相應(yīng)的‘阿爾岡金’(P<0.01)。同時(shí)，野生紫花苜蓿葉片RCA活性呈先下降后升高的趨勢(shì)，最大值出現(xiàn)在第12 d，較脅迫前顯著上升了227%(P<0.05)，且此時(shí)極顯著高于相應(yīng)的‘阿爾岡金’(P<0.01)；‘阿爾岡金’葉片的RCA活性則呈先上升后大幅下降的趨勢(shì)，峰值出現(xiàn)在脅迫后第4 d，較脅迫前顯著上升了155%(P<0.05)，且此時(shí)極顯著高于野生紫花苜蓿。在復(fù)水4 d后，野生紫花苜蓿葉片RCA活性比脅迫12 d大幅度顯著下降，‘阿爾岡金’葉片則顯著升高，但2種材料均顯著低于脅迫前。

圖1 干熱脅迫下紫花苜蓿Rubisco和RCA活性的變化

2.2 rbcL和rca基因序列擴(kuò)增結(jié)果

目的基因rbcL和rca的DNA片段電泳檢測(cè)結(jié)果(圖2)顯示，野生紫花苜蓿的2個(gè)基因擴(kuò)增序列總長(zhǎng)分別為633 bp和108 bp，與Genbank中紫花苜蓿Rubisco大亞基rbcL基因序列(MN601455.1)同源性為98%，與蒺藜苜蓿核酮糖二磷酸羧化酶小鏈3A(Ribulose bisphosphate carboxylase small chain 3A)的預(yù)測(cè)序列(XM_013592001.2)同源性為94 %；‘阿爾岡金’紫花苜蓿的2個(gè)基因擴(kuò)增序列總長(zhǎng)分別為632 bp和108 bp，與紫花苜蓿的rbcL基因序列(MN601455.1)同源性為98%，與蒺藜苜蓿預(yù)測(cè)序列(XM_013592001.2)的同源性為93%。結(jié)果表明2份紫花苜蓿材料的擴(kuò)增序列可確定為Rubisco大亞基rbcL基因和Rubisco活化酶的rca基因序列。

2.3 干熱脅迫下紫花苜蓿Rubisco的rbcL 和 rca 基因的表達(dá)水平

如圖3所示，野生紫花苜蓿材料的rbcL基因表達(dá)量在脅迫前、脅迫初期(4 d)及復(fù)水4 d后均顯著高于‘阿爾岡金’；同時(shí)，野生材料的rca基因表達(dá)量在脅迫第4 d和第8 d時(shí)也極顯著高于同期‘阿爾岡金’(P<0.01)。2個(gè)供試材料的rbcL和rca基因相對(duì)表達(dá)量受干熱脅迫的影響均先急劇升高，并均在脅迫的第4 d達(dá)到峰值，而后均呈快速下降趨勢(shì)。結(jié)果表明2種紫花苜蓿材料rbcL和rca基因表達(dá)量隨干熱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，且野生材料的基因表達(dá)水平總體高于‘阿爾岡金’。

圖2 rbcL和rca基因PCR擴(kuò)增電泳圖

圖3 干熱脅迫下紫花苜蓿Rubisco rbcL和rca基因相對(duì)表達(dá)量

2.4 干熱脅迫下紫花苜蓿Rubisco羧化酶及RCA酶活性與基因表達(dá)的關(guān)系

通過(guò)相關(guān)性分析(表1)發(fā)現(xiàn)，2份紫花苜蓿材料的Rubisco羧化酶、RCA酶活性與相應(yīng)的rbcL,rca基因表達(dá)量之間的相關(guān)性均不顯著，但rbcL與rca基因相對(duì)表達(dá)量之間均呈極顯著正相關(guān)，野生紫花苜蓿和‘阿爾岡金’紫花苜蓿中二者的相關(guān)系數(shù)分別為0.939(P=0.009)和0.973(P=0.003)。

3 討論

非生物脅迫可導(dǎo)致植物的Rubisco酶活性降低[27]，本研究中出現(xiàn)Rubisco酶活性先下降后升高的現(xiàn)象，可能是Rubisco酶對(duì)脅迫條件逐漸適應(yīng)的表現(xiàn)[28]。雖然2種供試材料的Rubisco酶活性變化趨勢(shì)相同，但野生紫花苜蓿的Rubisco酶活性總體高于‘阿爾岡金’紫花苜蓿，這可能是由于野生紫花苜蓿長(zhǎng)期生長(zhǎng)在干熱河谷地區(qū)[29]，能較好的適應(yīng)干熱氣候。野生紫花苜蓿在干熱條件下雖表現(xiàn)出較高的Rubisco羧化酶活性，但其與光合性能的關(guān)系是否存在特殊的耐干熱性仍需進(jìn)行系統(tǒng)地分析。

表1 紫花苜蓿Rubisco羧化酶及RCA酶活性與基因表達(dá)的相關(guān)性分析

‘阿爾岡金’紫花苜蓿的RCA酶活性在干熱脅迫第4 d時(shí)即達(dá)到峰值，但Rubisco酶活性此時(shí)仍在下降，可能是受高溫影響，Rubisco酶的失活速率超過(guò)了RCA促進(jìn)活化的能力[6]，也可以解釋為RCA酶的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致Rubisco的含量下降[30-31]，或與RCA和Rubisco空間構(gòu)象的變化、分子伴侶等因素有關(guān)[32-33]。野生紫花苜蓿的RCA酶活性在干熱脅迫第12 d時(shí)達(dá)到峰值，雖與Rubisco酶活性變化趨勢(shì)一致，但野生紫花苜蓿中該酶活性對(duì)干熱脅迫的響應(yīng)時(shí)間較‘阿爾岡金’晚，推測(cè)是由于野生紫花苜蓿中的RCA酶能及時(shí)調(diào)節(jié)Rubisco活性，對(duì)干熱的環(huán)境條件有較好的適應(yīng)性。

Rubisco大亞基A型與多活性酶全酶復(fù)合物的Rubisco活化活性有關(guān)[34]，本研究中干熱脅迫條件下紫花苜蓿的Rubisco羧化酶和RCA酶活性及其基因表達(dá)之間沒(méi)有顯著相關(guān)性，2種酶的體外活性與基因表達(dá)不協(xié)調(diào)，可能是由于基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯之間存在滯后性[35]，受轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾的影響，mRNA與蛋白量的變化不一定呈線性的關(guān)系[36]。本研究中2個(gè)供試紫花苜蓿材料的rbcL和rca基因表達(dá)量均隨干熱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下調(diào)，一方面可能是由于受高溫脅迫的影響，(新蛋白合成迅速?gòu)腞ubisco大亞基的主要表達(dá)轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕臒嵝菘说鞍譡37])，或是因?yàn)樵摶虻姆肿影閭H[38]蛋白受到脅迫表現(xiàn)為rbcL基因表達(dá)量下調(diào)；另一方面，有研究表明RCA在抑制茉莉酸(JA)誘導(dǎo)的葉片衰老中發(fā)揮了重要作用[39]，本研究中對(duì)紫花苜蓿葉片相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定歷時(shí)半月之久，因此基因表達(dá)的下調(diào)有可能是由于葉片逐漸衰老引起的。有研究表明AVP1/RCA的協(xié)同過(guò)量表達(dá)可以顯著提高擬南芥(Arabidopsisthaliana)在干旱和高溫條件下的耐受性[40]。rbcL和rca基因之間呈極顯著正相關(guān)，推測(cè)紫花苜蓿中的這2個(gè)基因之間可能存在協(xié)同表達(dá)，但對(duì)于基因的協(xié)同表達(dá)是否提高了干熱脅迫下紫花苜蓿的耐受性，亟需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

干熱脅迫顯著影響了2個(gè)供試紫花苜蓿Rubisco羧化酶和RCA酶的活性及其相關(guān)基因表達(dá)，但2種酶活性均與其基因表達(dá)之間無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系，而rbcL與rac基因表達(dá)量之間顯著正相關(guān)。