張宇，馬成華，景鵬舉，李培武

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院急救中心，甘肅蘭州730000

前言

骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是起源于間充質(zhì)原始骨細(xì)胞的惡性骨腫瘤，也是骨骼系統(tǒng)常見的惡性骨腫瘤［1-2］。好發(fā)于兒童和青少年，發(fā)病高峰為10～14歲［3］。常發(fā)病于長骨的干骺端，引起腫脹、疼痛、活動受限和病理性骨折等癥狀［4］。近年來，隨著外科手術(shù)和放化療的介入，OS 的5年生存率不斷提高，達(dá)到了70%左右［5］。但仍有30%的患者因術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移瘤化療耐藥等出現(xiàn)不良預(yù)后［6］。因此，尋找一種新的安全有效的治療方法來提高OS 患者的生存率顯得尤為重要。

低強(qiáng)度脈沖超聲（Low-Intensity Pulsed Ultrasound,LIPUS）是一種低頻低強(qiáng)度脈沖式的非侵入性超聲醫(yī)療技術(shù)［7］。其特征是對人體無損害，且易于應(yīng)用［8］。臨床廣泛用于促進(jìn)骨折愈合，促進(jìn)牽引成骨和治療骨折延遲愈合［9］。LIPUS 可能是通過調(diào)控成骨細(xì)胞增殖和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化來發(fā)揮其促進(jìn)骨折愈合的作用［10］。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)LIPUS 可調(diào)控OS 細(xì)胞的增殖和凋亡［11-12］，而PI3K/AKT/mTOR 信號通路在OS 的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，如可通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路來抑制OS 細(xì)胞的增殖［13］。因此，本研究假設(shè)LIPUS 可通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路進(jìn)而抑制OS細(xì)胞的增殖，給MG-63 細(xì)胞施加LIPUS 后，檢測細(xì)胞增殖能力和PI3K/AKT/mTOR 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，確定LIPUS 對MG-63 細(xì)胞和PI3K/AKT/mTOR 的影響，再分別使用PI3K/AKT/mTOR 信號通路的抑制劑和激動劑后觀察LIPUS 對MG-63 細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)而明確LIPUS 作用于MG-63細(xì)胞的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

主要試劑如下：MEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、PI3K-gamma 抗體（Abcam）、Anti-pan-AKT抗體（Abcam）、重組Anti-mTOR 抗體（Abcam）、Phospho-PI3K 抗體（Cell Signaling Technology，CST）、Phospho-Akt 抗體（CST）、Phospho-mTOR 抗體（CST）、PCNA 抗體（CST）、Cyclin D1 抗體（CST）、β-Actin 抗體（CST）和山羊抗兔（鼠）二抗（CST）等。主要儀器如下：低強(qiáng)度脈沖超聲儀（Metron GS170,澳大利亞）、細(xì)胞培養(yǎng)箱、顯微鏡和離心機(jī)等。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人骨肉瘤MG-63 細(xì)胞（購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫）解凍后置于培養(yǎng)瓶中，加5 mL由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和胎牛血清配置而成的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 換液一次，每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞長滿瓶底90%的區(qū)域后進(jìn)行傳代和凍存。

1.3 加載LIPUS

低強(qiáng)度脈沖超聲儀脈參數(shù)：脈沖頻率為100 Hz，脈沖寬度為2 ms，間隔時間為8 ms。在時間梯度實驗中，將超聲儀換能器平放于LIPUS 組細(xì)胞培養(yǎng)皿上分別加載1、6、12、18 和24 h。機(jī)制實驗分組為Control 組、LY294002（PI3K 的抑制劑）組、LIPUS 組和LIPUS+740Y-P（PI3K 的激動劑）組，Control組細(xì)胞不予處理，LY294002 組細(xì)胞使用LY294002 預(yù)處理，LIPUS組細(xì)胞則加載特定時間（由時間梯度實驗結(jié)果決定）的LIPUS，LIPUS+740Y-P 組細(xì)胞使用740Y-P預(yù)處理后加載特定時間（由時間梯度實驗結(jié)果決定）的LIPUS。

1.4 細(xì)胞活力檢測

使用CCK-8 檢測細(xì)胞活力，施加干預(yù)措施后，將各組細(xì)胞接種到96 孔板中。然后，將100 μL 含有10% CCK-8 試劑的培養(yǎng)基添加到每個孔中，并將細(xì)胞在37 ℃下孵育4 h。通過檢測吸光度來評估細(xì)胞活力。

1.5 Western Blots檢測

加載LIPUS 后滴加裂解液高速離心后收集各組的總蛋白，使用BCA 試劑盒測定各組的蛋白濃度，確定上樣量后，沸水煮5 min，標(biāo)記后冰箱凍存?zhèn)溆?。制膠后依次上樣，設(shè)定電泳參數(shù)后開始電泳，待溴酚藍(lán)到達(dá)膠底部時停止，以目標(biāo)蛋白分子量和Marker 的指示敷PVDF條帶后開始轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時間依蛋白分子量而定，電轉(zhuǎn)結(jié)束后孵育一抗1 h后4 ℃過夜，10×TBST洗膜3 次，共30 min，再孵育二抗1 h 后洗膜30 min，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液后曝光。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

各組數(shù)據(jù)重復(fù)3 次，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用單因素方差分析，條帶使用Image J 軟件處理，使用GraphPad Prism 8.0.2 軟件處理數(shù)據(jù)并作圖，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LIPUS抑制MG-63細(xì)胞的增殖

CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)加載LIPUS 1、6 和12 h 后，LIPUS 組的細(xì)胞增殖活力與Control 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而加載18 和24 h 后，LIPUS 組的細(xì)胞增殖活力較Control 組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.010,P＜0.001）。這些結(jié)果表明LIPUS可抑制MG-63細(xì)胞的增殖（圖1）。

圖1 CCK-8檢測加載LIPUS 1、6、12、18和24 h后MG-63細(xì)胞的增殖活力（**P＜0.01,***P＜0.001）Fig.1 Proliferation of MG-63 cells after loading LIPUS for 1,6,12,18 and 24 h were detected by CCK-8(**P＜0.01,***P＜0.001)

2.2 LIPUS對PI3K/AKT/mTOR信號通路的調(diào)控

對MG-63 細(xì)胞加載24 h LIPUS 后，使用Western Blots分別檢測p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR和mTOR的表達(dá)情況，結(jié)果如圖2a所示。如圖2b～圖2c所示，LIPUS可顯著抑制p-PI3K的表達(dá)（P＜0.001），而不影響PI3K 的表達(dá)（P=0.265）。如圖2d～圖2e 所示，與Control組相比，LIPUS組p-AKT的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001），而AKT的表達(dá)水平無明顯變化（P=0.371）。如圖2f～圖2g所示，LIPUS也顯著降低了p-mTOR的表達(dá)（P＜0.001），而不影響mTOR的表達(dá)（P=0.118）。上述結(jié)果表明LIPUS可抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的磷酸化，進(jìn)而抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路介導(dǎo)的細(xì)胞活動。

圖2 Western Blots檢測加載LIPUS 24 h后p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR和mTOR的表達(dá)水平（***P＜0.001,ns表示P＞0.05）Fig.2 Expression levels of p-PI3K,PI3K,p-AKT,AKT,p-mTOR and mTOR after loading LIPUS for 24 h were detected by Western Blots(***P＜0.001，ns indicates P＞0.05)

2.3 LIPUS通過PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制MG-63細(xì)胞的增殖

實驗組別為Control 組、LY294002（PI3K 的抑制劑）組、LIPUS 組和LIPUS+740Y-P（PI3K 的激動劑）組。CCK-8 結(jié)果顯示相較于Control 組，LY294002 組和LIPUS組MG-63細(xì)胞增殖活力顯著降低（P＜0.001）（圖3a），表明LIPUS 和PI3K/AKT/mTOR 信號通路的抑制劑LY294002 一樣可以抑制MG-63 細(xì)胞的增殖。與LIPUS 組相比，LIPUS+740Y-P 組MG-63 細(xì)胞的增殖活力顯著升高（P＜0.001）（圖3a），說明PI3K/AKT/mTOR 信號通路的激動劑740Y-P 可以逆轉(zhuǎn)LIPUS 對MG-63 細(xì)胞增殖的抑制。Western Blots 實驗也得出了相同結(jié)果（圖3b），如圖3c～圖3d 所示，相較于Control 組，LY294002 組 和LIPUS 組增殖相關(guān)蛋白PCNA（增殖細(xì)胞核抗原）和Cyclin D1 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001）。與LIPUS 組相比，LIPUS+740Y-P組PCNA和Cyclin D1的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.001）。綜上所述，這些結(jié)果說明LIPUS 可通過PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制MG-63細(xì)胞的增殖。

圖3 LY294002、LIPUS和740Y-9對MG-63細(xì)胞增殖的影響（***P＜0.001）Fig.3 Effects of LY294002,LIPUS and 740Y-9 on the proliferation of MG-63 cells(***P＜0.001)

3 討論

LIPUS作用于機(jī)體會產(chǎn)生兩種效應(yīng)，即超聲熱效應(yīng)和超聲非熱效應(yīng)，其中超聲非熱效應(yīng)又包括機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)等，LIPUS可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及成骨細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)骨折的愈合，已在臨床廣泛應(yīng)用，這可能與其對組織產(chǎn)生的非熱效應(yīng)有關(guān)［9］。LIPUS 可通過機(jī)械效應(yīng)影響腫瘤細(xì)胞膜的通透性進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，但其在腫瘤中的作用未得到充分的研究。據(jù)報道，LIPUS可增強(qiáng)阿霉素對淋巴瘤和肝癌細(xì)胞的毒性作用，提高化療效果［14］。Sawai 等［12］首次報道了將LIPUS 應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性骨腫瘤時，它可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化而不會促進(jìn)OS 細(xì)胞的增殖。據(jù)我們所知，尚沒有研究闡述LIPUS對OS增殖的調(diào)控作用以及其對PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響。因此，我們設(shè)計并開展了這項研究。本研究發(fā)現(xiàn)加載LIPUS 12 h 及以下時，不能抑制MG-63 細(xì)胞的增殖，加載18 h 及以上時可抑制MG-63 細(xì)胞的增殖，24 h 尤為明顯。與此同時，本研究檢測了LIPUS 對PI3K/AKT/mTOR 信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)LIPUS 可抑制p-PI3K、p-AKT 和p-mTOR 的表達(dá)，即抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路的激活，而不影響PI3K/AKT/mTOR 的表達(dá)。使用LIPUS 會和PI3K 的抑制劑一樣抑制MG-63 細(xì)胞的增殖，在使用PI3K 的激動劑740Y-P 后，可逆轉(zhuǎn)LIPUS 對MG-63 細(xì)胞增殖的抑制。這些結(jié)果表明LIPUS 可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路的激活來抑制OS 細(xì)胞的增殖。Matsuo 等［11］也報道了LIPUS 對OS 細(xì)胞的調(diào)控作用，他們發(fā)現(xiàn)LIPUS 會抑制LM8 細(xì)胞的增殖活力（P=0.002 2）和線粒體膜電位（P=0.001 9），流式細(xì)胞儀分析顯示LIPUS 組凋亡細(xì)胞（P＜0.000 1）和壞死細(xì)胞（P=0.009 1）的數(shù)量明顯高于對照組。在機(jī)制層面，他們發(fā)現(xiàn)LIPUS 顯著降低了p-akt（P＜0.000 1）和IκBα（P=0.000 1）的表達(dá)水平。本研究的結(jié)論與Matsuo 等［11］一樣，即LIPUS 可抑制OS 細(xì)胞的增殖，與之不相同的是，我們還深入探索了LIPUS對MG-63細(xì)胞的增殖調(diào)控機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)LIPUS 可通過下調(diào)p-PI3K、p-AKT 和p-mTOR 的表達(dá)進(jìn)而抑制MG-63細(xì)胞的增殖活力。這說明LIPUS 確實是一種有效抑制OS 細(xì)胞增殖的方法。Matsuo 等［11］還研究發(fā)現(xiàn)，LIPUS 會促進(jìn)OS 細(xì)胞的凋亡和壞死，這也進(jìn)一步證實LIPUS抗癌的有效性。

輔助化療已被證明對OS 有效［15］。盡管這種治療取得了顯著的進(jìn)步并提高了患者的存活率，但OS患者的預(yù)后仍然很差［16-17］。為了改善OS 患者的預(yù)后，有必要開發(fā)新型有效的輔助治療方法。LIPUS已被證實可有效抑制OS 細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，LIPUS 與化學(xué)療法或放射療法相結(jié)合，可能是治療OS 患者的有效療法［18-20］。LIPUS 無創(chuàng)且簡單易用，臨床中可通過對病灶處加載LIPUS 嘗試抑制OS 的進(jìn)展。但目前相關(guān)機(jī)制還未被闡述清楚，抑制OS 的LIPUS參數(shù)也未被清楚闡述。所以，今后還需要開展大量基礎(chǔ)研究明確LIPUS 調(diào)控OS 的具體機(jī)制，確定LIPUS 的最佳作用參數(shù)和加載時間，方可使OS 患者的收益最大化。此外，有研究報道了LIPUS 可提高化療藥物的敏感性，因此LIPUS 也許可通過聯(lián)合化學(xué)療法，提高現(xiàn)有OS 化療藥物的敏感性，降低耐藥性，提高OS患者的遠(yuǎn)期生存率。

本研究首次闡述了LIPUS 調(diào)控MG-63 細(xì)胞增殖的機(jī)制，為后續(xù)更多機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，也發(fā)現(xiàn)LIPUS 在物理治療OS 方面具有潛在價值。當(dāng)然，本研究也存在以下局限性：首先，本研究僅選用了MG-63 這一細(xì)胞系，所得結(jié)論未在其他OS 細(xì)胞系進(jìn)行驗證；其次，本研究沒有探索LIPUS 對OS 細(xì)胞侵襲、遷移和凋亡的調(diào)控作用；最后，本研究未探索不同LIPUS工作參數(shù)對OS細(xì)胞的調(diào)控作用。

低強(qiáng)度脈沖超聲可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路進(jìn)而抑制OS 細(xì)胞的增殖，由于其無創(chuàng)性，LIPUS可能會成為有效治療OS的療法之一。