祁全梅，李秋榮，郭青云

（青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院/農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站/ 青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧810016）

枸杞木虱（Paratrioza sinica Yang & Li）又稱豬嘴蜜、黃疸，屬半翅目（Hemiptera） 木虱科（Psylloidae）[1，2]，主要分布在寧夏、青海、甘肅、新疆、陜西和內(nèi)蒙古等地區(qū)[3]。其成蟲如小蟬，活動(dòng)范圍廣，全體黃褐色至黑褐色，具橙黃色斑紋，腹部背面近基部具1 條蠟白橫帶；若蟲形似介殼蟲，扁平，固著于葉面；卵橢圓形，具長柄，橙黃色[4～6]。枸杞木虱、枸杞蚜蟲和枸杞癭螨是為害枸杞的三大害蟲[7～9]，枸杞木虱成蟲和若蟲通過刺吸葉片組織吸食汁液，造成樹勢衰弱和早期落葉，導(dǎo)致果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)降低，經(jīng)濟(jì)收入減少，且枸杞木虱可攜帶枸杞癭螨越冬[10，11]。目前，枸杞木虱防治以化學(xué)藥劑為主，而長期使用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致枸杞木虱產(chǎn)生了一定的抗藥性，這不僅會(huì)造成環(huán)境污染，殺傷天敵，還會(huì)造成產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)[12～14]。因此，研究與開發(fā)綠色、高效藥劑或方法對(duì)枸杞木虱防治十分重要。

昆蟲的嗅覺是行為感覺的一種重要信號(hào)輸入來源，是其生存和繁衍的關(guān)鍵[15～18]。昆蟲氣味受體最初從黑腹果蠅中鑒定出來[19～21]，分為傳統(tǒng)型氣味受體（olfactory receptor，OR） 和非典型氣味受體（olfactory receptor coreceptor，ORCO）[22，23]。OR 分布在嗅覺感覺神經(jīng)元樹突的膜表面，氣味分子或氣味分子與OBPs 的復(fù)合物通過激活對(duì)應(yīng)的OR 傳遞嗅覺信號(hào)[24]，使昆蟲產(chǎn)生反應(yīng)；ORCO 介導(dǎo)的氣味分子與嗅覺神經(jīng)元的特異性結(jié)合是昆蟲重要的嗅覺識(shí)別基礎(chǔ)[25，26]，ORCO 與OR 相互作用形成的異源二聚體對(duì)昆蟲嗅覺具有重要作用[27]。不同昆蟲間的OR 多樣性豐富，同源性低；而ORCO 具有高度保守性[28]。當(dāng)ORCO 被干擾表達(dá)時(shí)，昆蟲將顯示出嗅覺缺陷，表明ORCO 有可能成為一個(gè)破壞嗅覺信號(hào)的分子靶標(biāo)，對(duì)嗅覺的干擾或破壞會(huì)影響昆蟲對(duì)氣味和性信息素的反應(yīng)，繼而影響到昆蟲取食以及交配和產(chǎn)卵等行為活動(dòng)[29～31]。

深入探索與昆蟲嗅覺相關(guān)的基因有助于昆蟲嗅覺機(jī)制的研究，可為害蟲的預(yù)防和治理提供新的方法[32，33]。但截至目前，有關(guān)枸杞木虱氣味受體基因的研究尚未見報(bào)道。本研究通過對(duì)枸杞木虱ORCO 基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在為進(jìn)一步研究驗(yàn)證該基因及其編碼蛋白在枸杞木虱識(shí)別寄主以及尋找異性和產(chǎn)卵場所等過程中所發(fā)揮的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 序列來源

分析枸杞木虱成蟲的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，篩選得到枸杞木虱ORCO 基因序列。

1.2 研究方法

利用分析軟件（表1），對(duì)枸杞木虱ORCO 基因及其編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、序列特性、結(jié)構(gòu)預(yù)測、進(jìn)化關(guān)系等生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞木虱ORCO 蛋白理化性質(zhì)分析

枸杞木虱ORCO 蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，該基因編碼450 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約51.25 KD，等電點(diǎn)為6.32。組成枸杞木虱ORCO 基因編碼蛋白的氨基酸有20 種，以亮氨酸含量（10.4%）最高，編碼蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為37.64，屬穩(wěn)定蛋白；ORCO 蛋白有37 個(gè)Arg+Lys 和33 個(gè)Asp+Lys；脂肪系數(shù)為96.76，總平均親水指數(shù)為0.254，為脂溶性蛋白。

2.2 枸杞木虱ORCO 蛋白亞細(xì)胞定位分析

枸杞木虱ORCO 蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果（表2）顯示，枸杞木虱ORCO 蛋白位于其他細(xì)胞器，而不在細(xì)胞核。

表2 枸杞木虱ORCO 蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果Table 2 Subcellular localization results of ORCO protein in P. sinica

2.3 枸杞木虱ORCO 蛋白跨膜區(qū)預(yù)測

枸杞木虱ORCO 蛋白跨膜區(qū)預(yù)測分析結(jié)果（圖1）顯示，該蛋白有7 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，分別在第34～56 位、第 62～84 位、第 124 ～146 位、第 195 ～217 位、第322～344 位、第 354～376 位和第 424～446 位處，其中第 1～33 位、第 85～123 位、第 218～321 位和第 377～423 位氨基酸在膜內(nèi)，第 57～61 位、第 147～194 位、第 345～353 位和第 447～450 位氨基酸在膜外。

圖1 枸杞木虱ORCO 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)Fig.1 Transmembranc structure of ORCO protein in P. sinica

2.4 枸杞木虱ORCO 蛋白信號(hào)肽預(yù)測

信號(hào)肽預(yù)測主要是由S 值大小判斷，S 值＞0.5 表示該蛋白屬分泌蛋白，反之則不屬分泌蛋白[34]。通過SignalP 5.0 對(duì)枸杞木虱ORCO 蛋白信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，其S 值為0.001 3（圖2），故該蛋白沒有信號(hào)肽。

圖2 枸杞木虱ORCO 蛋白信號(hào)肽預(yù)測Fig.2 Signal peptide prediction of ORCO protein in P. sinica

2.5 枸杞木虱ORCO 蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

枸杞木虱ORCO 編碼蛋白潛在磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果（圖3）顯示，6 個(gè)蘇氨酸、37 個(gè)絲氨酸和7 個(gè)酪氨酸是該蛋白潛在的磷酸化位點(diǎn)。

2.6 枸杞木虱ORCO 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

Smart 分析結(jié)果（圖4）顯示，枸杞木虱ORCO 蛋白在第59～440 位處有1 個(gè)Pfam：7tm_6 結(jié)構(gòu)域，其E值為 1.7e-88；在第 268～450 位處有 1 個(gè) Pfam：7tm_7 結(jié)構(gòu)域，其E 值為6.5e-9。

圖3 枸杞木虱ORCO 潛在磷酸化位點(diǎn)Fig.3 Potential phosphorylation sites of ORCO protein in P. sinica

圖4 枸杞木虱ORCO 蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.4 Conservative domains of ORCO protein in P. sinica

2.7 枸杞木虱ORCO 蛋白親疏水性分析

枸杞木虱ORCO 蛋白親疏水性分析結(jié)果（圖5）顯示，該基因編碼蛋白的最大疏水性值為3.322（第52 位），最小疏水性值為-2.856（第157 位），平均疏水性為0.254。表明ORCO 蛋白屬疏水性蛋白。

圖5 枸杞木虱ORCO 蛋白親疏水性Fig.5 Hydrophilicity and hydrophobicity of ORCO protein in P. sinica

2.8 枸杞木虱ORCO 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

枸杞木虱ORCO 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（圖6～8）顯示，枸杞木虱ORCO 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中有243 個(gè)α 螺旋、80 個(gè)直鏈延伸、17 個(gè)β 轉(zhuǎn)角和110 個(gè)無規(guī)則卷曲，分別占54.00%、17.78%、3.78%、24.44%。表明枸杞木虱ORCO 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α 螺旋為主。

圖6 枸杞木虱ORCO 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)序列Fig.6 Secondary structure sequence of ORCO protein in P. sinica

2.9 枸杞木虱ORCO 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

在線分析預(yù)測枸杞木虱ORCO 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖9）顯示，枸杞木虱ORCO 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α 螺旋和無規(guī)則卷曲纏繞折疊形成。

2.10 枸杞木虱ORCO 進(jìn)化樹分析

圖7 枸杞木虱ORCO 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 The secondary structure prediction of ORCO Protein in P. sinica

圖8 枸杞木虱ORCO 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)峰值變化圖Fig.8 Secondary structure peak change graph of ORCO protein in P. sinica

圖9 枸杞木虱ORCO 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.9 Tertiary structure of ORCO protein in P. sinica

從枸杞木虱非典型氣味受體進(jìn)化樹（圖10）可以看出，昆蟲的ORCO 基因以目為分類單元進(jìn)行聚類，近緣種只檢索到黃偽毛蚜（Sipha flava）、桃蚜（Myzus persicae）、豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）、棉蚜（Aphis gossypii）、玉米蚜 （Hopalosiphum maidis） 和高粱蚜（Melanaphis sacchari）等半翅目蚜科昆蟲，枸杞木虱的ORCO 與這些蚜科昆蟲聚為一支；而鞘翅目和鱗翅目昆蟲的ORCO 則形成獨(dú)立的分支。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，枸杞木虱ORCO 編碼450 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約51.25 KD，等電點(diǎn)為6.32，屬于穩(wěn)定蛋白，亞細(xì)胞定位預(yù)測枸杞木虱ORCO 蛋白主要分布在其他細(xì)胞器而不是細(xì)胞核，這與向侯君等[30]對(duì)斑翅果蠅ORCO 基因的分析結(jié)果相似；枸杞木虱ORCO基因是具有7 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，N 末端在胞內(nèi)、C 末端在胞外的的G 蛋白偶聯(lián)受體，這與雙委夜蛾、麥蛾、懸鈴木方翅網(wǎng)蝽等昆蟲的 ORCO 基因特性[27，34～39]相同。

通過基因S 值對(duì)枸杞木虱ORCO 蛋白信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測，該蛋白基因S 值（0.001 3）＜0.5，不屬分泌蛋白。通過蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析可知，枸杞木虱ORCO在第6 與第7 跨膜區(qū)、第7 跨膜區(qū)具高度保守結(jié)構(gòu)域。親疏水性分析發(fā)現(xiàn)，該蟲ORCO 基因編碼蛋白屬于疏水性蛋白。枸杞木虱ORCO 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋為主，且無規(guī)則卷曲和直鏈延伸也占有一定比例；三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α 螺旋和無則規(guī)卷曲纏繞折疊形成，ORCO 基因在結(jié)構(gòu)上的高度保守性說明其在昆蟲的一系列生命活動(dòng)中有著至關(guān)重要的作用。

本研究利用生物信息學(xué)軟件對(duì)柴達(dá)木地區(qū)枸杞的主要害蟲枸杞木虱ORCO 基因及其編碼蛋白的理化性質(zhì)、序列特性、結(jié)構(gòu)預(yù)測和進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行了系統(tǒng)分析，為研究枸杞木虱新的防治靶標(biāo)奠定了理論基礎(chǔ)，而對(duì)枸杞木虱ORCO 基因的克隆、蛋白表達(dá)和功能驗(yàn)證有待下一步研究。

圖9 枸杞木虱與其它昆蟲ORCO 的進(jìn)化樹Fig.9 Phylogenetic tree of ORCO protein in P. sinica with other insects