劉冬

(東南大學(xué) 附屬中大醫(yī)院，江蘇 南京 210009)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)病因可為非創(chuàng)傷性，也可為創(chuàng)傷性。創(chuàng)傷性SCI為SCI的嚴(yán)重并發(fā)癥之一, 多由高處墜落、交通事故、體育運(yùn)動(dòng)意外等導(dǎo)致，患者損傷平面以下肢體發(fā)生嚴(yán)重功能障礙，對其身心造成極大的痛苦[1- 2]。手術(shù)解除壓迫、物理治療、急性期大量激素治療均是臨床使用較多的治療SCI的方法，目前研究較多的還有神經(jīng)再生及神經(jīng)保護(hù)療法，但均未取得較大突破[3- 4]。因此，闡明SCI的分子機(jī)制很有必要。

SCI包括兩種損傷機(jī)制，即原發(fā)性和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷(機(jī)械損傷、出血等)為不可逆損傷，多出現(xiàn)于損傷后4 h內(nèi)。原發(fā)損傷引發(fā)復(fù)雜的繼發(fā)性損傷級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)行性死亡、 局部缺血及炎癥[5- 6]。由于繼發(fā)性損傷的可干預(yù)性，如何通過發(fā)生機(jī)制進(jìn)行研究和給予有效的治療策略成為近些年來關(guān)注的熱點(diǎn)。隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，高通量基因芯片技術(shù)等開始普及于疾病發(fā)生發(fā)展過程中分子變化的探索，這為SCI發(fā)病機(jī)制的研究提供了新方向。在最近的許多生物信息學(xué)研究中，分析了SCI后的不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組[7- 8]，并對各種分子事件進(jìn)行了表征，進(jìn)一步說明了免疫應(yīng)答、炎癥相關(guān)功能、脈管系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)功能在SCI的發(fā)展中發(fā)揮了作用[9- 11]。

在本研究中，利用GSE45006轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，分別評估損傷后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即1 d、3 d和1周的差異表達(dá)基因(DEG)以進(jìn)行通路和功能富集分析，構(gòu)建蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，并通過軟件分析關(guān)鍵基因，以揭示可能與SCI相關(guān)的分子機(jī)制，同時(shí)為SCI的治療提供潛在靶標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 微陣列數(shù)據(jù)分析

NCBI- GEO為微陣列和基因表達(dá)譜的免費(fèi)公共數(shù)據(jù)庫，從中獲得數(shù)據(jù)集GSE45006 SCI組和假手術(shù)組脊髓組織中的全基因組基因表達(dá)概況。測序平臺為GPL1355 ([Rat230_2] Affymetrix Rat Genome 230 2.0 Array)，使用動(dòng)脈瘤夾沖擊壓縮損傷模型損傷大鼠胸脊髓(T7)，并分離受傷脊髓的震中區(qū)域組織，在基因芯片陣列上行后續(xù)檢測，其中包括4個(gè)假手術(shù)組和20個(gè)SCI組。

1.2 DEG數(shù)據(jù)處理

使用在線分析工具GEO2R 篩選DEG[12]。在本研究中，數(shù)據(jù)分為以下成對的組：在1、3 d和1、2、8周的假手術(shù)組和SCI組，通過P<0.05和|logFC|>2作為臨界點(diǎn)選擇DEG，然后在Draw Venn Diagram(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)輸入TXT格式的原始數(shù)據(jù)，在線比較DEG并構(gòu)建Venn圖。

1.3 功能富集分析

利用DAVID(http：∥david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp)在線數(shù)據(jù)進(jìn)行KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 途徑分析[13], 同時(shí)利用WebGestalt(WEB- based GEne SeT AnaLysis Toolkit，http:∥www.webgestalt.org)在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO (gene ontology)分析，從生物過程(biological process, BP)、細(xì)胞組分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF) 3個(gè)方面注釋差異基因的功能, WebGestalt是目前進(jìn)行DEG功能注釋的權(quán)威數(shù)據(jù)庫[14]。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)和模塊分析

通過在線工具STRING(檢索相互作用基因的搜索工具)來評估PPI信息[15]。然后，使用Cytoscape[16]中的STRING應(yīng)用程序檢查這些DEG之間的潛在相關(guān)性。此外，通過Cytoscape中的MCODE應(yīng)用程序用于檢查PPI網(wǎng)絡(luò)的模塊預(yù)測關(guān)鍵基因。

2 結(jié) 果

2.1 確定差異表達(dá)基因

通過GEO2R在線工具，數(shù)據(jù)歸一化，評估交叉可比性(圖1)，分析5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的DEGs。與假手術(shù)組比較，在1、3 d和1、2、8周，SCI組分別有1 189、591、741、568、571個(gè)DEGs上調(diào)；966、294、537、438、432個(gè)DEGs下調(diào)(圖2)。DEGs數(shù)量變化波動(dòng)結(jié)果表明基因表達(dá)改變發(fā)生在損傷后1、3 d和1周。用韋恩圖網(wǎng)站分別識別1 d、3 d和1周的DEGs，共監(jiān)測到369種DEGs，包括SCI震中組織中的248個(gè)上調(diào)基因(logFC>0)和121個(gè)下調(diào)基因(logFC<0)(圖3和表1)。

2.2 功能富集分析

通過WebGestalt數(shù)據(jù)庫對全部369種DEGs進(jìn)行分析，GO分析結(jié)果表明：(1) BP主要涉及生物調(diào)節(jié)、對刺激的反應(yīng)、代謝過程、定位、發(fā)育過程等；(2) CC主要涉及細(xì)胞膜、細(xì)胞核、含蛋白質(zhì)復(fù)合物、內(nèi)膜系統(tǒng)、胞漿細(xì)胞等；(3) MF主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合、核苷酸結(jié)合、水解酶活性、核算結(jié)合等(圖4)。通過DAVID數(shù)據(jù)庫對全部369種DEGs進(jìn)行分析，KEGG分析結(jié)果如表2所示?？傮w而言，本研究中DEGs主要與免疫和炎癥功能相關(guān)。

圖1 假手術(shù)組和SCI組基因表達(dá)的箱型圖數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和交叉可比性

圖2 假手術(shù)組和SCI組在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的DEG數(shù)量

左：3個(gè)數(shù)據(jù)集中上調(diào)了248個(gè)DEGs(logFC>0)；右：3個(gè)數(shù)據(jù)集中下調(diào)了121個(gè)DEGs(logFC<0)

2.3 PPI和模塊分析

通過STRING在線數(shù)據(jù)庫輸入369個(gè)DEGs，分析構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，將得到的數(shù)據(jù)利用Cytoscape軟件進(jìn)行更全面的生物信息學(xué)分析。利用MCODE插件進(jìn)行模塊分析，得到20個(gè)中心節(jié)點(diǎn)(圖5)。

2.4 20個(gè)選定基因重新KEGG富集分析

為了了解這20 個(gè)DEGs可能涉及的通路途徑，再次使用DAVID數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行了KEGG分析。結(jié)果顯示，5個(gè)基因(CCNA2、Cdk1、Mcm2、Mcm4、Mcm6)顯著富集于細(xì)胞周期途徑中(圖6)。

3 討 論

動(dòng)物SCI的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵驯粡V泛用于研究復(fù)雜的脊髓繼發(fā)性級聯(lián)損傷[17]。GSE45006數(shù)據(jù)集包括了SCI后1、3 d和1、2、8周5個(gè)時(shí)間點(diǎn)受傷脊髓的震中區(qū)域組織中以及假手術(shù)組脊髓組織中獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。本研究采用生物信息學(xué)分析確定SCI中的分子事件和病理狀態(tài)?；诓煌瑫r(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)分析，確定3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的共同DEGs，并進(jìn)行KEGG和GO的富集分析。此外，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和行模塊分析進(jìn)一步了解SCI的分子過程，最后再把選中的基因進(jìn)行KEGG分析。本研究中進(jìn)行的分析可能有助于更好地理解SCI。

本研究KEGG和GO富集分析表明，1、3 d和1周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的共同DEGs主要與免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)有關(guān)。炎癥是繼發(fā)性SCI過程的標(biāo)志[18]。如前所述，SCI的嚴(yán)重程度與急性炎癥反應(yīng)(其中包括促炎癥細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞)強(qiáng)度之間存在關(guān)聯(lián)。促炎癥因子(IL- 1b、IL- 6和IL- 7)和抗炎癥細(xì)胞因子(IL- 4和IL- 10)的表達(dá)顯著增加，反映了受損組織的變性與存活之間的調(diào)控[18- 19]。一種保護(hù)性策略是針對炎癥過程并限制免疫細(xì)胞向損傷部位的浸潤[20- 21]。值得注意的是，另一組與炎癥相關(guān)的基因，包括Cd44、Cybb、Icam1、Cyba、Hck、Casp1、Tgfb1、Rac2、Itgb2和Cxcr4與促炎癥因子(IL- 1β、IL- 6和IL- 7)相比表現(xiàn)出不同的時(shí)間模式，表明受損部位存在復(fù)雜的炎癥性免疫微環(huán)境，需要進(jìn)一步分析。這些發(fā)現(xiàn)確認(rèn)了SCI后隨時(shí)間推移重復(fù)進(jìn)行炎癥檢測的重要性[18]。

表1 脊髓損傷組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測到的所有369個(gè)DEGs(248個(gè)上調(diào)基因和121個(gè)下調(diào)基因)

細(xì)胞周期蛋白A2(CCNA2)是一種在G1期積累的細(xì)胞周期蛋白，在G1/S和G2/M的過渡時(shí)期起調(diào)節(jié)作用[22]。有研究[23]表明，在SCI早期急性期的生物信息學(xué)分析中，PPI網(wǎng)絡(luò)中顯示CCNA2是排名前10位的核心基因。SCI引起與認(rèn)知及情感變化相關(guān)的腦部炎癥，這可能與M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的延遲持續(xù)誘導(dǎo)及相關(guān)的細(xì)胞周期活化有關(guān)，從而導(dǎo)致認(rèn)知缺陷和生理性抑郁[24]。

SCI可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)活性增加，包括CDK1，并增加細(xì)胞周期蛋白B1(CCNB1，是CDK1的主要激活因子)的水平，此外在體外實(shí)驗(yàn)或者大鼠SCI模型中抑制E2F1/CDK1信號通路具有神經(jīng)保護(hù)功能[25]。

微染色體維持復(fù)合物(MCM)在確定細(xì)胞復(fù)制潛力中起著至關(guān)重要的作用，而且在細(xì)胞對DNA損傷的反應(yīng)中也起著至關(guān)重要的作用。事實(shí)上，MCM蛋白不僅與S期檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)器相互作用，還與DNA修復(fù)途徑有關(guān)[26- 27]。MCM2基因在大鼠SCI中起到關(guān)鍵作用[28]。

有不少研究證明CCNA2、cdKI、Mcm2、Mcm4、Mcm6這5個(gè)基因可能與SCI的預(yù)后有關(guān)，但從PubMed網(wǎng)站上搜索這5個(gè)基因來看，關(guān)于SCI的報(bào)道很少，因此本研究數(shù)據(jù)可以為SCI的進(jìn)一步研究提供有用的信息和方向。

本研究的局限性在于原始數(shù)據(jù)不包括損傷后6個(gè)月的慢性期，也不包括非常急性期(SCI后0.5、4 h)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)以及KEGG和GO富集分析數(shù)據(jù)，這限制了SCI發(fā)展過程中有關(guān)分子過程的信息。同時(shí)，SCI組所取組織僅僅為損傷震中區(qū)域的組織，如果通過獲得其他位置組織的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行全面分析，可能會進(jìn)一步揭示病理生理過程中發(fā)生的復(fù)雜變化。

圖4 對3個(gè)時(shí)間點(diǎn)369個(gè)DEGs行GO分析

表2 對3個(gè)時(shí)間點(diǎn)369個(gè)DEGs行KEGG分析

A.節(jié)點(diǎn)代表蛋白質(zhì)，節(jié)點(diǎn)大小取決于其與蛋白質(zhì)的連接程度；B.通過Cytoscape軟件進(jìn)行模塊分析得到20個(gè)紅心節(jié)點(diǎn)，均為上調(diào)基因(degree cutoff=2, max. Depth=100, k- core=2, and node score cutoff=0.2)

圖6 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對20個(gè)選定基因重新進(jìn)行KEGG分析

綜上所述，本研究表明炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)在SCI過程中起著重要的作用。此外，CCNA2、Cdk1、Mcm2、Mcm4、Mcm6這5種基因可能在SCI的發(fā)展機(jī)制中扮演重要角色。當(dāng)然，具體的分子機(jī)制還需要大量地進(jìn)行生物實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證，這樣才能對SCI分子機(jī)制的認(rèn)知提供堅(jiān)實(shí)可信的依據(jù)。