崔莉莉，陳 勇，張蒙偉，鄢紅霞,3，高守紅，陳萬生 （. 上海長征醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200000；2. 宜春學(xué)院，江西 宜春 336000；3. 云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650000）

新型冠狀病毒肺炎（簡稱新冠肺炎，COVID-19），具有較強的人際傳播能力，傳播速度快[1-3]。COVID-19 患者會出現(xiàn)與流感類似的癥狀，包括發(fā)燒、咳嗽、乏力、腹瀉等，重癥患者出現(xiàn)呼吸困難或低氧血癥，可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、多器官功能衰竭等導(dǎo)致死亡[4]。中醫(yī)藥早期干預(yù)可有效預(yù)防病情向重、危重方向惡化[5]。目前，中醫(yī)藥控制COVID-19 的療效普遍受到重視[6]，業(yè)界提倡結(jié)合不同疾病階段使用不同的處方[2]。寒濕郁肺湯為武漢火神山醫(yī)院依據(jù)國家衛(wèi)健委印發(fā)的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》所引進的四種肺炎診療中藥湯劑處方之一，用于新型冠狀病毒初期治療，該湯劑由蒼術(shù)、陳皮、厚樸、藿香、草果、生麻黃、羌活、生姜共八味中藥組方而成。

UHPLC-MS/MS 因具有分離能力強，檢測限低，高靈敏度，高選擇性等特點，易于開發(fā)為臨床檢測項目的參考方法[7]。本研究應(yīng)用UHPLC-MS/MS法，依照2015 版中國藥典對寒濕郁肺湯中11 種主成分進行含量測定，為后續(xù)的質(zhì)量研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1290 超高效液相色譜儀（包括G4220A二元高壓泵、G4226A 自動進樣器、G1330B 控溫箱、G1316C 柱溫箱）、Agilent G6460A 型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、電噴霧離子源、Mass Hunter 化學(xué)工作站B.06.00（美國Agilent 公司）；BSA124SCW 型天平、CPA225D 型天平（德國Sartorius 公司）；Mini spin 型離心機、移液槍（德國Eppendorf公司）；Labnet VX-200 型定時可調(diào)速渦旋混合器（美國Labnet 公司）；SK7200H 型超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；UNIVERSAL32R 型臺式冷凍離心機（德國Hettich 公司）。

1.2 試劑和藥品

香草酸（批號：H11J9Z65318）、厚樸酚（批號：Y27J10C91584）、和厚樸酚（批號：T28O6B5149）、漢黃芩素（批號：T11J11R108209）、刺槐素（批號：C12O8Q45551）、6-姜酚（批號：P29O10F101611）、桔皮素（批號：H24F11K108893）、羌活醇（批號：R28M9F57295）、川陳皮素（批號：N10J10R90249）、紫花前胡苷（批號：W07A10Z94862）、利血平（批號：Y02M11Y17235）、橙皮苷（批號：P06D9F77001）均為對照品，純度均≥97%，購于上海源葉生物科技有限公司；甲醇（批號：10951907818，質(zhì)譜級）、乙腈（批號：JA075930，質(zhì)譜級）購自德國默克公司；甲酸（批號：17033D，分析純）、乙酸銨（批號：H1709024，色譜純）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；水為屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司），其余試劑均為分析純。

1.3 樣品

寒濕郁肺湯中蒼術(shù)（批號：20092108）、陳皮（批號：20010181）、厚樸（批號：20061903）、藿香（批號：20031708）、草果（批號：19092902）、生麻黃（批號：20200301）、羌活（批號：20070709）等中藥材均由上海長征醫(yī)院藥材科提供，生姜（批號：19062404）購于廣西壯族自治區(qū)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液

分別取各對照品適量，精密稱定，用甲醇配制成含1.01 mg/ml 香草酸、0.99 mg/ml 厚樸酚、1.03 mg/ml和厚樸酚、1.00 mg/ml 漢黃芩素、1.00 mg/ml 刺槐素、1.01 mg/ml 6-姜酚、1.02 mg/ml 桔皮素、1.01 mg/ml羌活醇、1.03 mg/ml 川陳皮素、1.00 mg/ml 紫花前胡苷、1.00 mg/ml 利血平（IS）和1.00 mg/ml 橙皮苷的對照品溶液，于?20 ℃冰箱保存，備用。

2.1.2 供試品溶液

取寒濕郁肺湯中蒼術(shù)15 g、陳皮10 g、厚樸10 g、藿香10 g、草果6 g、生麻黃6 g、羌活10 g、生姜10 g，精密稱定，置鍋中，加水500 ml，浸泡30 min，加熱至煮沸后調(diào)至文火煎20 min，取藥液；第二次加水300 ml，加熱至煮沸后調(diào)至文火煎20 min，取藥液，與第一次藥液混勻，取出，放冷。精密量取藥液1 ml，加入1 μg/ml 的利血平10 μl，渦旋3 min，14 500 r/min 離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱( 3.5 μm，2.1 mm×150 mm )，流動相為0.2%甲酸水?10 mmol/L醋酸銨溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～0.6 min,80%～40% A; 0.6～1 min, 40%～30% A; 1～4.3 min,30%～5% A；流速：0.3 ml/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μl，每個樣品的分析周期為4.3 min。

2.2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI）和多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。正負離子同時掃描；氮氣作為霧化氣和干燥氣；高純氮氣為碰撞氣，毛細管電壓為4 000 V；碰撞氣壓為40 psi；鞘流氣溫為350 ℃，干燥氣溫為325 ℃，干燥氣流速為12 L/min；將一定濃度的標準溶液和內(nèi)標溶液進樣，在ESI 電離方式下進行產(chǎn)物離子全掃描分析（見圖1），定量分析質(zhì)荷比詳見表1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察

分別精密吸取空白溶劑、對照品溶液和供試品溶液各10 μl，按“2.1.2”項下方法制樣，再按照“2.2”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣測定，記錄圖譜。結(jié)果顯示，專屬性符合相關(guān)要求（圖2）。

2.3.2 線性關(guān)系的考察

精密量取對照品溶液適量，濃度稀釋為如下的混合對照品溶液：香草酸、厚樸酚、和厚樸酚、漢黃芩素、刺槐素、桔皮素、羌活醇、紫花前胡苷的線性濃度為20、50、100、200、500、1 000、1 500、2 000 ng/ml；6-姜酚、川陳皮素、橙皮苷的線性濃度為200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、15 000、20 000 ng/ml。采用內(nèi)標定量法按“2.2”項下色譜與質(zhì)譜條件進行測定，并記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標（Y），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（C），繪制標準曲線，并進行線性回歸，結(jié)果見表2。

圖1 寒濕郁肺湯中11 個主成分及內(nèi)標的二級產(chǎn)物離子圖

表1 寒濕郁肺湯中11 個主成分及內(nèi)標的質(zhì)譜檢測參數(shù)

2.3.3 精密度試驗

將母液稀釋10 倍，按“2.2”項下色譜與質(zhì)譜條件進行測定，連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，計算RSD。結(jié)果顯示，香草酸、厚樸酚、和厚樸酚、漢黃芩素、刺槐素、6-姜酚、桔皮素、羌活醇、川陳皮素、紫花前胡苷、橙皮苷11 種成分的峰面積RSD 分別為1.83%、5.57%、4.39%、3.14%、4.25%、4.01%、1.26%、1.40%、1.75%、3.29%、2.55%，表明該方法精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗

取同一份寒濕郁肺湯供試品溶液，按“2.1.2”項下方法平行制備6 份，按“2.2”項下色譜與質(zhì)譜條件進行測定，記錄峰面積，計算RSD。結(jié)果顯示，香草酸、厚樸酚、和厚樸酚、漢黃芩素、刺槐素、6-姜酚、桔皮素、羌活醇、川陳皮素、紫花前胡苷、橙皮苷11 種化學(xué)成分的峰面積RSD 分別為4.78%、8.40%、5.55%、3.27%、1.51%、3.30%、1.30%、3.37%、1.21%、1.98%、2.46%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液，按“2.1.2”項下方法制備，室溫放置，按“2.2”項下色譜與質(zhì)譜條件，分別于0、2、4、6、12、16、24 h 進樣測定，記錄峰面積，計算RSD。結(jié)果顯示，香草酸、厚樸酚、和厚樸酚、漢黃芩素、刺槐素、6-姜酚、桔皮素、羌活醇、川陳皮素、紫花前胡苷、橙皮苷11 種化學(xué)成分在4 h 內(nèi)的峰面積RSD 分別為5.81%、4.68%、3.17%、13.09%、13.20%、 8.99%、 6.19%、 5.19%、 4.18%、 5.55%、9.47%，表明供試品溶液在室溫放置4 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖2 寒濕郁肺湯中11 個主成分及內(nèi)標的MRM 色譜圖

表2 寒濕郁肺湯中11 種成分的線性考察

2.3.6 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的寒濕郁肺湯樣品，加入各對照品適量，平行制備6 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣測定，進行UHPLC-MS/MS 分析，計算各待測物的平均回收率及其RSD。11 種待測物：香草酸、厚樸酚、和厚樸酚、漢黃芩素、刺槐素、6-姜酚、桔皮素、羌活醇、川陳皮素、紫花前胡苷、橙皮苷的平均加樣回收率分別為111.73%、102.96%、108.94%、102.90%、99.36%、104.83%、100.55%、100.27%、105.49%、96.92%、93.11%，RSD 分別為2.44%、2.37%、4.44%、1.92%、4.60%、2.57%、1.79%、2.36%、4.99%、3.08%、3.59%，表明該方法的準確度良好。

2.3.7 樣品含量測定

取9 批寒濕郁肺湯藥材，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜與質(zhì)譜條件進行測定，計算寒濕郁肺湯9 批樣本中11 種成分：香草酸、厚樸酚、和厚樸酚、漢黃芩素、刺槐素、6-姜酚、桔皮素、羌活醇、川陳皮素、紫花前胡苷、橙皮苷的含量，測定結(jié)果為香草酸0.07～0.09 μg/ml、厚樸酚0.06～0.07 μg/ml、和厚樸酚0.26～0.57 μg/ml、漢黃芩素0.07～0.09 μg/ml、刺槐素0.27～0.29 μg/ml、6-姜酚0.55～0.58 μg/ml、桔皮素0.31～0.33 μg/ml、羌活醇0.54～0.58 μg/ml、川陳皮素3.78～3.81 μg/ml、紫花前胡苷0.31～0.33 μg/ml、橙皮苷1.58～1.61 μg/ml。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

在預(yù)實驗中分別考察了Agilent ZORBAX SB C18（3.5 μm，2.1 mm ×100 mm）、Agilent ZORBAX SB-C18（3.5 μm，2.1 mm×150 mm）、Waters Xbridge?HILIC（3.5 μm，2.1 mm×100 mm）、Waters Atlantis?T3（3 μm，2.1 mm×100 mm）、Agilent Eclipse XDBC18（3.5 μm，2.1 mm×150 mm）等色譜柱對11 個待測成分含量測定的影響，結(jié)果顯示，當色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（3.5 μm，2.1mm×150 mm）時，11 個待測成分及內(nèi)標的峰形最佳。

3.2 流動相的優(yōu)化

實驗中分別考察了水-乙腈、0.1%甲酸水-乙腈、0.15%甲酸水-乙腈、0.2%甲酸水-乙腈、5 mmol/L 醋酸銨溶液-乙腈、10 mmol/L 醋酸銨水-乙腈、0.2%甲酸-10 mmol/L 醋酸銨水溶液-甲醇、0.2%甲酸-10 mmol/L 醋酸銨水溶液-乙腈等流動相對11 個成分含量測定的影響，結(jié)果顯示，此11 個待測成分在0.2%甲酸-10 mmol/L 醋酸銨水溶液-乙腈中，采用梯度洗脫，響應(yīng)與峰形均佳。

3.3 內(nèi)標與化學(xué)成分的選擇

在預(yù)實驗中分別考察了培美曲塞、利血平、卡馬西平三個標準品作為內(nèi)標時的響應(yīng)和出峰時間，最終選用了出峰時間居中、響應(yīng)好、穩(wěn)定性高的利血平作為內(nèi)標。本實驗中所選取的化學(xué)成分以藥典為基礎(chǔ)，結(jié)合文獻調(diào)研，舍棄揮發(fā)油類成分及違禁成分，最終選取了11 個能代表藥材的化學(xué)成分進行研究。

4 結(jié)語

本研究基于UHPLC-MS/MS 同時測定寒濕郁肺湯中11 個成分含量的方法，經(jīng)色譜柱、流動相的優(yōu)化和全面的方法學(xué)考察，成功應(yīng)用于樣品中寒濕郁肺湯11 種成分的測定。該法簡便可靠，可為寒濕郁肺湯中的成分檢測提供一定的方法參考，也為寒濕郁肺湯的質(zhì)量控制及質(zhì)量標準研究奠定了基礎(chǔ)。