華 榮，陳 瑤 （泰州市人民醫(yī)院藥學(xué)部臨床藥學(xué)科，江蘇 泰州 225300）

盆腔炎是一種常發(fā)病于年輕女性上生殖道感染的婦科疾病。臨床研究發(fā)現(xiàn)，盆腔炎患者上生殖道內(nèi)存在大量激活的巨噬細(xì)胞[1]。在炎癥和病原體的刺激下，巨噬細(xì)胞過度激活可以釋放出大量炎癥因子，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α），白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（IL-18）。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3 炎性小體激活可以促使caspase-1 活化并切割I(lǐng)L-18、IL-1β 前體，促進(jìn)IL-18、IL-1β 的成熟與釋放，而抑制NLRP3 炎性小體過度激活以減輕盆腔炎臨床癥狀，并且與降低炎癥因子、趨化因子釋放有關(guān)。巨噬細(xì)胞在不同刺激下可以活化為不同表型：經(jīng)典活化的M1 型和替代活化的M2 型。在含有脂多糖（LPS）和IFN-γ 微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞活化為變形蟲樣的M1 型，參與炎癥的發(fā)生。巨噬細(xì)胞在含有IL-4、IL-10、IL-13 等抗炎因子微環(huán)境中被活化為M2 型，表達(dá)精氨酸酶 1(Arg-1)和甘露糖受體1(CD206) 等特異性標(biāo)志分子，參與炎癥消退和組織重塑。研究發(fā)現(xiàn)，M1 /M2 比例失衡是多種炎癥性疾病的病理標(biāo)志，如肥胖[2]、糖尿病[3]、動脈粥樣硬化[4]等。

益母草堿（LEO）是一種具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤作用的天然黃酮類化合物[5]，研究報(bào)道顯示益母草堿可抑制Bax/Bcl-2 信號通路激活抑制炎癥因子的表達(dá)[6]。但鮮有益母草堿對巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體影響的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以益母草堿為研究對象，探討其對巨噬細(xì)胞中NLRP3 炎癥小體激活的影響，以及對巨噬細(xì)胞M1/M2 表型的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

益母草堿（純度＞98%，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，上海）；脂多糖（L6143）、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、NuPAGE 10% Bis-Tris Gel、10×MOPS SDS 運(yùn)行緩沖液、10×傳輸緩沖液、預(yù)制蛋白Marker、熒光定量PCR、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司）；青-鏈霉素混合液、胰蛋白酶（美國Hyclone 公司）；Griess 試劑盒（江蘇碧云天生物試劑公司）；IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α 等ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物公司）；PVDF 膜（美國Millipore 公司）；caspase-1 兔抗單克隆抗體、β-actin兔抗單克隆抗體、羊抗兔/羊抗鼠單克隆二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；NLRP3 兔抗單克隆抗體（英國Biorbyt 生物試劑公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)溶液（MTT，美國Bio-Rad 公司）；TRIzol Regent 試劑盒（日本TaKaRa 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

C57BL/6 小鼠，6 周齡，雌性，體重(20±2) g，購于江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。小鼠飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室SPF 級動物房，溫度（22 ± 1）°C 和濕度（60 ± 2）%，動物自由飲食。動物實(shí)驗(yàn)操作均通過實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及給藥

以頸椎脫臼的方式處死小鼠，置于75%的乙醇溶液中浸泡10 min，將15 ml PBS 緩沖液注入小鼠腹中，仰臥平放，揉捏小鼠腹部5 min，吸出腹液，離心分離巨噬細(xì)胞，用DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中以5%CO2、37 ℃恒溫孵育24 h后，換液，去除未貼壁細(xì)胞，即得到純化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞[7]。以1.5×105個(gè)/ml 密度接種于24 孔（或96 孔）板中培養(yǎng)24 h 后，隨機(jī)分為空白組、益母草堿（10 μmol/L）組、脂多糖（1 μg/ml）組、脂多糖+益母草堿（10 μmol/L）組，益母草堿預(yù)處理1 h之后加入脂多糖，放回孵箱中培養(yǎng)，24 h 后，提取上清液和細(xì)胞蛋白，檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.4 MTT 檢測細(xì)胞活性

脂多糖預(yù)處理巨噬細(xì)胞24 h 后，在96 孔板中每孔加入10 μl（5 mg/ml）MTT 溶液，于37 ℃孵箱中培養(yǎng)，4 h 后取出，移除細(xì)胞上清液，每孔加入200 μl 二甲基亞砜，放置于恒溫?fù)u床震搖10 min，于562 nm 處測定OA 值，檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.5 Griess 試劑盒檢測NO 含量

Griess 試劑盒取出，恢復(fù)至室溫。將細(xì)胞上清液和標(biāo)準(zhǔn)品和加入到96 孔板中，將試劑I 和試劑II 混勻加入96 孔板中，避光，放置于恒溫?fù)u床震搖30 min，于470 nm 處測定OA 值，檢測NO 含量。

1.6 ELISA 試劑盒檢測IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α含量

提前將ELISA 試劑盒取出，恢復(fù)至室溫。稀釋細(xì)胞上清液，配置標(biāo)準(zhǔn)品工作液，按照ELISA 試劑盒說明書要求依次加入反應(yīng)液，最后加入終止液，于450 nm 處檢測OD 值，計(jì)算IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α 含量。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量（RT-PCR）實(shí)驗(yàn)

按照Trizol 法提取巨噬細(xì)胞中總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)。設(shè)定反應(yīng)條件為：5 ℃預(yù)變性30 s，接著95 ℃變性6 s，最后60 ℃退火，延伸37 s，重復(fù)反應(yīng)40 個(gè)循環(huán)。RT-PCR引物設(shè)計(jì)見（表1）。以GAPDH 為內(nèi)參，利用2?ΔΔCt方法分析結(jié)果。

表1 PCR 引物序列

1.8 Western blot 檢測蛋白NLRP3、ASC、caspase-1的表達(dá)

脂多糖處理巨噬細(xì)胞24 h 后，棄去細(xì)胞上層培養(yǎng)基，置于冰上，PBS 洗滌3 次，加入RIPA 裂解液（含1%PMSF）反應(yīng)30 min，離心，收集上清液。BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白含量，配置緩沖液，變性。每孔10 μl 加入到10%預(yù)制膠中，設(shè)置電壓200 V 電泳30 min，設(shè)置電壓25 V 電轉(zhuǎn)30 min，TBST 洗滌，5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST 洗滌，4 ℃一抗孵育過夜，TBST 洗滌，二抗孵育30 min，TBST洗滌，加入曝光劑，曝光。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS18.0 分析實(shí)驗(yàn)中所涉及的數(shù)據(jù)，組間比較方差齊，用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊采用 Dunnett's T3 檢驗(yàn)，以P ＜ 0.05 為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)誤（xˉ±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 益母草堿對巨噬細(xì)胞活力的影響

圖1 益母草堿對巨噬細(xì)胞活力的影響

首先，觀察益母草堿和脂多糖對巨噬細(xì)胞活力的影響（圖1）。結(jié)果顯示，脂多糖和益母草堿均能提高巨噬細(xì)胞的活力（P＜0.05），當(dāng)益母草堿與脂多糖共同刺激巨噬細(xì)胞時(shí)，巨噬細(xì)胞活力得到了進(jìn)一步的增強(qiáng)（P＜0.05）。

2.2 益母草堿抑制巨噬細(xì)胞NO、IL-1β、IL-6 及IL-18 釋放

觀察益母草堿對巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放的影響，在脂多糖刺激下，巨噬細(xì)胞上清液中NO 的釋放增加，而益母草堿可以抑制巨噬細(xì)胞NO 釋放（圖2A）。檢測脂多糖對巨噬細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-18 和IL-6 釋放的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，益母草堿可以降低巨噬細(xì)胞IL-1β、IL-18 和IL-6 釋放（圖2B-2D）。結(jié)果顯示，益母草堿可以減少脂多糖引起的巨噬細(xì)胞炎癥因子的釋放。

2.3 益母草堿抑制脂多糖引起的巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體激活

細(xì)胞內(nèi)IL-1β、IL-18 等炎癥因子的釋放需要經(jīng)過NLRP3 炎癥小體的激活，為此，觀察了益母草堿對NLRP3 炎癥小體激活的影響。RT-PCR 結(jié)果顯示（圖3），脂多糖刺激后，NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA 表達(dá)增加，益母草堿可以降低mRNA 表達(dá)。Western blot 結(jié)果也證實(shí)益母草堿可以抑制脂多糖引起的巨噬細(xì)胞中NLRP3、ASC、caspase-1 蛋白表達(dá)（圖4）。

2.4 益母草堿調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞由M1 型向M2 型轉(zhuǎn)化

圖2 益母草堿對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO、IL-1β、IL-6 及IL-18 的影響

應(yīng)用RT-PCR 檢測益母草堿對巨噬細(xì)胞M1/M2表型的影響。正常情況下，巨噬細(xì)胞M1 型標(biāo)志物TNF-α 和iNOS 表達(dá)量較低，經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)刺激后TNF-α 和iNOS 的表達(dá)水平顯著升高，益母草堿可以降低脂多糖引起的TNF-α 和iNOS 的mRNA 表達(dá)（圖5A 和5B）。另一方面，脂多糖誘導(dǎo)刺激后，巨噬細(xì)胞M2 型標(biāo)志物Arg-1 和CD206 的表達(dá)水平降低，益母草堿預(yù)處理可以增加脂多糖引起的Arg-1 和CD206 表達(dá)（圖5C 和5D）。表明益母草堿可以調(diào)控脂多糖引起的巨噬細(xì)胞由M1 向M2 型轉(zhuǎn)化。

圖3 益母草堿對NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白mRNA 表達(dá)影響

圖4 益母草堿對NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖5 益母草堿調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞由M1/M2 型極化

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)在盆腔炎患者的上生殖道內(nèi)存在大量激活的巨噬細(xì)胞[8]。巨噬細(xì)胞是參與炎癥反應(yīng)的天然免疫細(xì)胞，當(dāng)病原體入侵或者組織發(fā)生病變時(shí)，巨噬細(xì)胞分泌多種炎癥因子，誘導(dǎo)更多的巨噬細(xì)胞活化、募集，加強(qiáng)局部抗炎作用。正常生理情況下，炎癥因子的含量極少，具有維持機(jī)體免疫和調(diào)節(jié)心腦血管等功能[9]。但當(dāng)機(jī)體長期受到病原微生物、致炎因子刺激時(shí)，會導(dǎo)致一系列病理改變，如長期慢性子宮內(nèi)膜炎刺激可以增加子宮纖維化的發(fā)病率[10]?；诖耍緦?shí)驗(yàn)利用革蘭陰性菌來源的脂多糖刺激巨噬細(xì)胞，觀察益母草堿對脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞激活和炎癥因子表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，脂多糖刺激可以引起巨噬細(xì)胞過度激活，相關(guān)炎癥因子表達(dá)增加，益母草堿預(yù)處理可以減少炎癥因子的表達(dá)和分泌，提示益母草堿的抗炎作用與抑制巨噬細(xì)胞中炎癥因子的產(chǎn)生有關(guān)。

為了進(jìn)一步闡明益母草堿的抗炎作用，本實(shí)驗(yàn)對NLRP3 炎癥小體進(jìn)行了研究。大量研究發(fā)現(xiàn)脂多糖可以激活NLRP3 炎癥小體，引起細(xì)胞因子釋放增加。鑒于盆腔炎是炎性刺激引起的病理變化，且抑制NLRP3 炎癥小體可以降低炎癥，推測抑制NLRP3 炎癥小體過度激活可能對盆腔炎起到一定的治療效果。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，益母草堿可以通過抑制脂多糖引起的巨噬細(xì)胞中NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)，從而減少炎癥因子釋放，證實(shí)益母草堿可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3 炎癥小體的過度激活發(fā)揮抗炎作用。

巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化在盆腔炎的病理進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，M1 型巨噬細(xì)胞主要發(fā)揮促炎、吞噬病原體的作用，M2 型巨噬細(xì)胞主要發(fā)揮促進(jìn)組織重塑、損傷修復(fù)等。因此，在盆腔炎疾病中，M1 型巨噬細(xì)胞能夠加重上生殖道炎癥進(jìn)展，而M2 型巨噬細(xì)胞能抑制疾病進(jìn)展。為了明確脂多糖對巨噬細(xì)胞分化的影響，使用RT-PCR 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不同處理方式對巨噬細(xì)胞分型的影響。結(jié)果顯示，脂多糖能夠促進(jìn)M1 型標(biāo)志物TNF-α 和iNOS 的mRNA 表達(dá)，而益母草堿能明顯抑制 TNF-α 和iNOS的mRNA 表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)M2 型標(biāo)志物Arg-1 和CD206 的mRNA 表達(dá)。上述結(jié)果提示，益母草堿能抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1 型分化以及IL-18、IL-1β、TNF-α 表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 型分化。

在炎癥反應(yīng)過程中，脂多糖可以引起巨噬細(xì)胞中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α 等炎癥因子表達(dá)增加，益母草堿可以通過抑制NLRP3 炎癥小體激活發(fā)揮其抗炎作用，提示抑制NLRP3 炎癥小體過度激活可能成為盆腔炎治療的新策略，同時(shí)，本研究也為進(jìn)一步開發(fā)益母草堿作為婦科用藥提供理論基礎(chǔ)。