栗志遠(yuǎn)，周 鐸，閆 瓊，王新紅 （陸軍第九五二醫(yī)院，青海 格爾木 816099）

嚙齒類動物暴露于各種環(huán)境和實驗等應(yīng)激刺激條件下，產(chǎn)生許多行為和生理性應(yīng)激反應(yīng)[1-2]。應(yīng)激刺激可致嚙齒類動物痛閾升高，痛覺敏感性降低而誘發(fā)鎮(zhèn)痛，即應(yīng)激鎮(zhèn)痛。測定痛閾的方法有壓尾法、甩尾法、熱板法和壓腳法等[1]。根據(jù)應(yīng)激刺激的特點（如應(yīng)激源，持續(xù)時間，強度和時間模式），鎮(zhèn)痛可能由內(nèi)源性阿片系統(tǒng)或其他非阿片的激素和神經(jīng)生化機制調(diào)解[2-3]。

旋轉(zhuǎn)刺激可誘發(fā)嚙齒類動物發(fā)生暈動病癥狀，例如異食癖，條件性厭食癥，自發(fā)活動減少和激素水平變化等[4-6]。腎上腺酮等激素水平的升高，提示某些前庭刺激，如旋轉(zhuǎn)亦可誘發(fā)嚙齒類動物應(yīng)激鎮(zhèn)痛反應(yīng)，引起應(yīng)激鎮(zhèn)痛的旋轉(zhuǎn)亦是誘發(fā)嚙齒類動物暈動病的有效前庭刺激條件?？梢?，以角加速度為主的平面旋轉(zhuǎn)刺激，可誘發(fā)小鼠暈動病和應(yīng)激鎮(zhèn)痛反應(yīng)。因此，研究旋轉(zhuǎn)誘發(fā)的暈動病與應(yīng)激鎮(zhèn)痛之間功能聯(lián)系的機制非常有意義[7-8]。二者都是通過相同的前庭刺激引起的，反應(yīng)程度都依賴于應(yīng)激刺激強度、類型和持續(xù)時間等。而且，重復(fù)的旋轉(zhuǎn)刺激易致小鼠對鎮(zhèn)痛耐受和暈動病的習(xí)服。

本實驗以熱板潛伏期為指標(biāo)，在以角加速度為主的水平旋轉(zhuǎn)刺激下，觀察了化學(xué)迷路切除對小鼠旋轉(zhuǎn)誘發(fā)的應(yīng)激鎮(zhèn)痛和嗎啡鎮(zhèn)痛的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物

嗎啡原料（青海制藥廠）；納洛酮原料（北京四環(huán)藥廠）；對氨基苯胂酸（Sigma 公司）。

1.1.2 動物

健康昆明種小鼠，雌性，體重：18～22 g。小鼠為清潔級，實驗動物質(zhì)量合格證號：SCXK（滬）2002－0002，由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物部提供。

1.1.3 儀器

智慧園區(qū)建設(shè)是為了迎合智慧城市建設(shè)發(fā)展需要，對于園區(qū)可持續(xù)發(fā)展意義深遠(yuǎn)，就智慧園區(qū)需求來看，應(yīng)該做好網(wǎng)絡(luò)建設(shè)工作，滿足智慧園區(qū)建設(shè)多樣化需要。

小鼠旋轉(zhuǎn)儀：由控制裝置和旋轉(zhuǎn)裝置兩部分組成?？刂蒲b置可調(diào)節(jié)并顯示旋轉(zhuǎn)裝置的旋轉(zhuǎn)速度、旋轉(zhuǎn)時間和變速周期。本實驗選擇轉(zhuǎn)速250 r/min，旋轉(zhuǎn)時間1 min，變速周期為每旋轉(zhuǎn)15 s 停止5 s。

旋轉(zhuǎn)裝置位于控制裝置上方，為一可旋轉(zhuǎn)的方形有機玻璃板（21 cm×21 cm×0.2 cm），旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)盤的對角線的四角排列著4 個可以容納小鼠的三角形有機玻璃小盒，小盒中心距離旋轉(zhuǎn)軸心均為10 cm。在250 r/min 轉(zhuǎn)速下，旋轉(zhuǎn)時小鼠頭朝向離心端，旋轉(zhuǎn)半徑為10 cm。

熱板儀：由電熱恒溫水浴鍋和熱板組成。電熱恒溫水浴鍋可程控設(shè)置，并顯示水浴溫度，溫度控制精確到0.1 ℃。熱板為紫銅板焊接而成的25 cm×14 cm×7 cm（長×寬×高）的槽形體，底部嵌入水浴水面下5 cm，以保證熱板受熱充分而均勻，由于浮力使熱板槽卡緊在水浴鍋中。

2 方法

2.1 小鼠鎮(zhèn)痛實驗[9]

應(yīng)用小鼠旋轉(zhuǎn)儀和熱板儀。熱板的水浴指示溫度為（55.0±0.5）℃。實驗時室溫維持在23～25 ℃，環(huán)境濕度和照明度等應(yīng)控制相對恒定，減小系統(tǒng)誤差。實驗時旋轉(zhuǎn)刺激前先測定2 次小鼠熱板反應(yīng)時間（即放入熱板至首次舔后足時間）取其平均值作為基礎(chǔ)潛伏期，挑選基礎(chǔ)潛伏期在10～20 s 的小鼠作為實驗動物，2 次測定間隔至少5 min。旋轉(zhuǎn)后熱板反應(yīng)時間在30～50 s 較合適。如舔后足潛伏期超過60 s，應(yīng)中止熱板刺激，以免燙傷足底。

2.2 納洛酮對嗎啡鎮(zhèn)痛和旋轉(zhuǎn)誘發(fā)應(yīng)激鎮(zhèn)痛的影響

取雌性小鼠32 只，隨機分為4 組，每組8 只：①嗎啡（5 mg/kg，sc）+生理鹽水（10 ml/kg，ip）；②嗎啡（5 mg/kg，sc）+納洛酮（4 mg/kg，ip）；③生理鹽水（10 ml/kg，ip）+旋轉(zhuǎn)刺激；④納洛酮（4 mg/kg，ip）+旋轉(zhuǎn)刺激。①②組小鼠給藥15 min 后即刻測定熱板潛伏期；③④組小鼠給藥15 min 后開始旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)結(jié)束后即刻測定熱板潛伏期。

2.3 旋轉(zhuǎn)刺激對嗎啡耐受小鼠應(yīng)激鎮(zhèn)痛的影響

取雌性小鼠20 只，隨機分為2 組，每組10 只，即生理鹽水對照組（10 ml/kg，sc）和嗎啡組（5 mg/kg，sc）。每天給藥2 次（上午9 時，下午4 時），連續(xù)給藥7 d。d0、d1、d3、d5 和d7 下午給藥15 min 后分別測定小鼠熱板潛伏期。首次給藥前（d0）和末次給藥后（d7）15 min 分別測定旋轉(zhuǎn)后小鼠熱板潛伏期。

2.4 化學(xué)迷路切除術(shù)[10-11]

取雌性小鼠16 只，隨機分為前庭損傷組（對氨基苯胂酸鈉）和假損傷組（生理鹽水），每組8 只。取0.3 mol/L 的NaHCO3溶液加至100 mg/ml 的對氨基苯胂酸溶液中，調(diào)節(jié)pH 中性即可形成對氨基苯胂酸鈉溶液。動物經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，注射針穿過鼓膜向鼓室內(nèi)注射對氨基苯胂酸鈉溶液或生理鹽水0.04～0.06 ml，注射完畢后用火棉膠緊緊塞住以防藥液滲漏。監(jiān)測動物直到麻醉蘇醒可放入飼養(yǎng)籠恢復(fù)3～5 d。

2.5 前庭器功能評價[12-13]

將小鼠置于去芯的50 ml 注射器外管中使其呈仰臥位。正常小鼠能感受體位顛倒，并且在數(shù)秒內(nèi)翻正顛倒的體位；前庭損傷小鼠則難以感受顛倒的體位而不能翻轉(zhuǎn)或體位翻正時間延長。實驗中觀察并記錄小鼠翻正反射恢復(fù)時間。

2.5.2 游泳試驗

將小鼠置于20 cm × 40 cm 的盛水容器中，溫度控制在(23 ± 2)℃，觀察小鼠在60 s 內(nèi)頭部露出水平面游泳的時間。正常動物可在60 s 內(nèi)一直保持頭部露出水面游泳，而前庭損傷者頭部常難以浮出水面。

2.6 化學(xué)迷路切除小鼠鎮(zhèn)痛行為變化

前庭功能評價后，先測定2 次小鼠熱板反應(yīng)時間取其平均值作為基礎(chǔ)潛伏期。然后，測定前庭損傷和假損傷小鼠旋轉(zhuǎn)后熱板潛伏期。

最后，觀察迷路切除對嗎啡鎮(zhèn)痛作用的影響。給予嗎啡（5 mg/kg，sc）15 min 后測定前庭損傷和假損傷小鼠熱板潛伏期。

2.7 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示。采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行多元方差分析（MANOVA）和單因素方差分析（LSD 法）、t 檢驗，α=0.05 視為檢驗水準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 納洛酮對嗎啡鎮(zhèn)痛或旋轉(zhuǎn)誘發(fā)應(yīng)激鎮(zhèn)痛的影響

同時注射嗎啡和納洛酮15 min 后，小鼠熱板潛伏期顯著低于生理鹽水對照組（P＜0.01），納洛酮顯著降低了嗎啡組小鼠熱板潛伏期。旋轉(zhuǎn)刺激后，納洛酮組小鼠熱板潛伏期與生理鹽水組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見圖1。

圖1 納洛酮對嗎啡鎮(zhèn)痛和旋轉(zhuǎn)誘發(fā)應(yīng)激鎮(zhèn)痛的影響（n=8）

本實驗結(jié)果表明，阿片受體拮抗劑納洛酮可拮抗嗎啡的鎮(zhèn)痛作用，但不能拮抗旋轉(zhuǎn)誘發(fā)的應(yīng)激鎮(zhèn)痛作用，提示旋轉(zhuǎn)誘發(fā)的熱板潛伏期延長與嗎啡鎮(zhèn)痛作用機制可能不同，或旋轉(zhuǎn)誘發(fā)的小鼠熱板潛伏期延長是可能通過非阿片系統(tǒng)起作用的。

3.2 旋轉(zhuǎn)刺激對嗎啡耐受小鼠應(yīng)激鎮(zhèn)痛的影響

圖2 所示，嗎啡組小鼠隨給藥天數(shù)增加，熱板潛伏期逐漸縮短。d1、d3 和d5 嗎啡組小鼠熱板潛伏期顯著高于生理鹽水組（P＜0.01）；d7 末次給藥后2 組小鼠熱板潛伏期無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）?？梢姡瑔岱冉M小鼠于d7 已形成嗎啡耐受。

圖3 所示，給藥前（d0）和末次給藥后（d7），嗎啡組和生理鹽水組小鼠旋轉(zhuǎn)后熱板潛伏期均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)果提示，嗎啡鎮(zhèn)痛和旋轉(zhuǎn)誘發(fā)的應(yīng)激鎮(zhèn)痛無交叉耐受性。

3.3 前庭功能評價

圖2 嗎啡鎮(zhèn)痛作用和耐受形成(n=10)

圖3 旋轉(zhuǎn)刺激對嗎啡耐受小鼠熱板潛伏期的影響(n=10)

接觸翻正反射試驗中，給予對氨基苯胂酸溶液組小鼠在注射器中翻正所需時間顯著高于生理鹽水組（P＜0.01）。游泳試驗中，給予生理鹽水組小鼠在60 s 內(nèi)一直保持頭部露出水面游泳，而給予對氨基苯胂酸組小鼠身體在水中螺旋翻滾，頭部難以浮出水面，兩組小鼠60 s 內(nèi)頭部露出水面游泳時間的差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01），結(jié)果見圖4。

圖4 小鼠前庭功能評價(n=8)

3.4 化學(xué)迷路切除對小鼠應(yīng)激鎮(zhèn)痛的影響

旋轉(zhuǎn)刺激后，假損傷組小鼠自發(fā)活動減少而旋轉(zhuǎn)行為增加，而前庭損傷組小鼠自發(fā)活動在旋轉(zhuǎn)前后無明顯變化。從圖5 顯示，旋轉(zhuǎn)前假損傷組和前庭損傷組小鼠基礎(chǔ)潛伏期無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而旋轉(zhuǎn)后前庭損傷組小鼠熱板潛伏期顯著降低（P＜0.01），其數(shù)值幾乎接近旋轉(zhuǎn)前的基礎(chǔ)潛伏期水平（旋轉(zhuǎn)前12.8 s，旋轉(zhuǎn)后13.9 s），而假損傷組小鼠旋轉(zhuǎn)后熱板潛伏期為38.3 s（旋轉(zhuǎn)前12.5 s）。結(jié)果提示，化學(xué)迷路切除可能完全阻滯了旋轉(zhuǎn)誘發(fā)的小鼠應(yīng)激鎮(zhèn)痛作用。

圖5 化學(xué)迷路切除對小鼠旋轉(zhuǎn)后熱板潛伏期的影響（n=8）

注射嗎啡15 min 后，前庭假損傷組和前庭損傷組小鼠熱板潛伏期無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖6）。結(jié)果提示，化學(xué)迷路切除對小鼠嗎啡鎮(zhèn)痛作用無明顯影響。

圖6 化學(xué)迷路切除對嗎啡鎮(zhèn)痛作用的影響(n=8)

4 討論

應(yīng)激是機體在受到各種強烈因素（即應(yīng)激原）剌激時出現(xiàn)的以交感神經(jīng)興奮和垂體-腎上腺皮質(zhì)分泌增多為主的一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，并由此而引起的各種功能和代謝的改變。一定強度的任何軀體的或情緒的剌激，都可以成為應(yīng)激原，如創(chuàng)傷、缺氧、疼痛等。嚙齒類動物如大鼠或小鼠在電擊足底，冷水游泳，固定，掐尾巴，離子輻射，或離心旋轉(zhuǎn)等應(yīng)激刺激下，痛覺敏感性均減弱，這一現(xiàn)象被稱為“應(yīng)激鎮(zhèn)痛”[1,6-7]。

阿片受體拮抗劑納洛酮可拮抗嗎啡對小鼠的鎮(zhèn)痛作用，使小鼠熱板潛伏期顯著下降?？梢姡瑔岱孺?zhèn)痛是通過阿片系統(tǒng)介導(dǎo)的。而旋轉(zhuǎn)刺激誘發(fā)的痛閾上升不能被納洛酮阻斷，即旋轉(zhuǎn)后納洛酮和生理鹽水對照組小鼠熱板潛伏期間無顯著差異。結(jié)果提示，旋轉(zhuǎn)刺激誘發(fā)的應(yīng)激鎮(zhèn)痛可能是非阿片系統(tǒng)介導(dǎo)的。此外，旋轉(zhuǎn)刺激對嗎啡耐受小鼠應(yīng)激鎮(zhèn)痛的影響實驗結(jié)果也顯示，嗎啡耐受小鼠和生理鹽水對照小鼠旋轉(zhuǎn)刺激后的熱板潛伏期無顯著差異，表明嗎啡鎮(zhèn)痛和旋轉(zhuǎn)誘發(fā)的應(yīng)激鎮(zhèn)痛無交叉耐受性，證實旋轉(zhuǎn)誘發(fā)的應(yīng)激鎮(zhèn)痛是非阿片系統(tǒng)介導(dǎo)的。因此，旋轉(zhuǎn)誘發(fā)的應(yīng)激鎮(zhèn)痛與嗎啡鎮(zhèn)痛的作用機制可能不同。

誘發(fā)暈動病的旋轉(zhuǎn)等前庭刺激條件也可以誘發(fā)小鼠應(yīng)激鎮(zhèn)痛，提示旋轉(zhuǎn)刺激誘發(fā)的應(yīng)激鎮(zhèn)痛和暈動病效應(yīng)可能存在共同的中樞機制。前庭器官在暈動病的發(fā)生中起著重要作用[12-13]。本實驗中小鼠旋轉(zhuǎn)后熱板潛伏期顯著高于旋轉(zhuǎn)前的熱板潛伏期，提示該前庭刺激誘發(fā)了應(yīng)激鎮(zhèn)痛，前庭器官在旋轉(zhuǎn)誘發(fā)的應(yīng)激鎮(zhèn)痛中也起重要作用。

本實驗進一步探討了前庭器官在小鼠旋轉(zhuǎn)誘發(fā)的應(yīng)激鎮(zhèn)痛中的作用。采用內(nèi)耳注射對氨基苯胂酸溶液對小鼠施行化學(xué)迷路切除術(shù)[12-13]。游泳行為和翻正反射評估的是半規(guī)管和耳石器功能，是能夠全面評價前庭功能的兩個重要參數(shù)。評價小鼠前庭功能的小鼠接觸翻正反射和游泳試驗結(jié)果顯示，對氨基苯胂酸組小鼠接觸翻正反射時間顯著高于生理鹽水對照組，而頭部露出水面游泳時間顯著低于生理鹽水對照組，提示對氨基苯胂酸成功損傷小鼠前庭功能，化學(xué)迷路切除術(shù)成功。

化學(xué)迷路切除小鼠旋轉(zhuǎn)后熱板潛伏期顯著降低，且與旋轉(zhuǎn)前熱板潛伏期無明顯差異；而正常對照小鼠旋轉(zhuǎn)后熱板潛伏期顯著高于旋轉(zhuǎn)前，表明化學(xué)迷路切除可能完全抑制或阻滯了旋轉(zhuǎn)誘發(fā)的應(yīng)激鎮(zhèn)痛。另外，小鼠化學(xué)迷路切除與否，對嗎啡的鎮(zhèn)痛作用無影響，進一步提示旋轉(zhuǎn)誘發(fā)的應(yīng)激鎮(zhèn)痛與嗎啡鎮(zhèn)痛作用機制可能不同，前庭器官在旋轉(zhuǎn)誘發(fā)的應(yīng)激鎮(zhèn)痛中作用明顯。

總之，動物行為學(xué)實驗表明，前庭器官在旋轉(zhuǎn)誘發(fā)的應(yīng)激鎮(zhèn)痛中起重要作用，而前庭系統(tǒng)究竟如何調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)誘發(fā)的應(yīng)激鎮(zhèn)痛有待進一步的驗證和研究。