范 鍥，李文浩，丘德贊，黃孝英，李浩曦，何基琛

骨肉瘤是一種罕見(jiàn)的肉瘤類型，但它也是最為常見(jiàn)骨組織來(lái)源的惡性腫瘤，常常因早期的肺轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致極差的預(yù)后[1～3]。骨肉瘤可發(fā)生在所有年齡段，但兒童發(fā)病更為常見(jiàn)，占全球所有兒科惡性腫瘤患者的2.4%[4]。阿霉素(adriamycin，ADM)屬于化療藥物的一種,這種蒽環(huán)類抗生素能夠減緩或阻滯癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[5,6]，已被臨床應(yīng)用于治療包括骨肉瘤在內(nèi)的各種類型的癌癥[7]。與其他化療藥物一樣，雖然ADM對(duì)癌細(xì)胞有殺傷作用，但最終也會(huì)因癌細(xì)胞對(duì)ADM產(chǎn)生耐藥性而失效[8,9]。此外，毒副作用降低了患者治療的成功率。因此，有必要探討增強(qiáng)ADM作用的新方法，以降低其臨床用藥量。異硫氰酸苯乙酯(phenethyl isothiocyanate，PEITC)是多種十字花科蔬菜中天然存在的異硫氰酸酯的化合物，是重要的異硫氰酸酯類家族成員之一[10,11]。PEITC可調(diào)節(jié)前列腺癌、白血病和骨髓瘤細(xì)胞的表觀遺傳過(guò)程，并抑制組蛋白去乙酰酶[12～14]。有研究[15]表明，PEITC可抑制不同類型腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外，PEITC在臨床中也已被證明可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，并協(xié)同增強(qiáng)化療藥物誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡[16]。本研究旨在通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討PEITC與ADM對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的協(xié)同作用及相關(guān)機(jī)制，為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 骨肉瘤U2-OS細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；ADM購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；PEITC購(gòu)自TCI公司；細(xì)胞凋亡蛋白酶(Caspase)-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)海門市碧云天生物技術(shù)研究所；Caspase-3抗體、Caspase-9抗體、細(xì)胞表面死亡受體Fas抗體、細(xì)胞表面死亡受體配體FasL抗體購(gòu)自美國(guó)genetech公司；二抗購(gòu)自中國(guó)南京金斯瑞生物科技有限公司；甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒購(gòu)自中國(guó)Solarbio公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%濃度胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)U2-OS細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱條件設(shè)置為5% CO2、37 ℃。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況進(jìn)行細(xì)胞傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U2-OS細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 選取呈現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的U2-OS細(xì)胞，稀釋至5×104cells/ml，以100 μl/孔種植到96孔無(wú)菌培養(yǎng)板中，以37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)6～12 h，待細(xì)胞貼壁。ADM組分別按照1 μg/ml、2.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml和25 μg/ml的ADM藥物終濃度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理，PEITC組分別按照2 μM/ml、4 μM/ml、8 μM/ml、16 μM/ml、32 μM/ml和64 μM/ml的PEITC藥物終濃度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理。繪制細(xì)胞增殖曲線并分別計(jì)算ADM和PEITC的半抑制濃度(IC50)。另外，應(yīng)用MTT法檢測(cè)ADM聯(lián)合PEITC對(duì)細(xì)胞增殖的影響，選取呈現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的U2-OS細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104cells/ml，每孔加入100 μl。分組及干預(yù)方法如下：ADM 1組(2 μg/ml ADM)、ADM 2組(3 μg/ml ADM)、ADM 3組(10 μg/ml ADM)；PEITC 1組(1 μM/ml PEITC)、PEITC 2組(2 μM/ml PEITC)、PEITC 3組(5 μM/ml PEITC)；A+P 1組(2 μg/ml ADM+1 μM/ml PEITC)、A+P 2組(3 μg/ml ADM+2 μM/ml PEITC)、A+P 3組(10 μg/ml ADM+5 μM/ml PEITC)、空白對(duì)照組(未添加藥)。每孔終體積100 μl，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μl MTT溶液，使用ST360酶標(biāo)儀(上?？迫A公司)進(jìn)行檢測(cè)，在570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)并記錄其OD值。抑制率=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白孔OD值)/空白孔OD值×100%。Q值的計(jì)算公式如下:Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)。Ea和Eb分別表示單獨(dú)使用ADM和PEITC的抑制率;Ea+b為ADM與PEITC聯(lián)合抑制率。Q值>1.15表示協(xié)同效應(yīng);0.85≤Q值≤1.15為相加效應(yīng)，Q值<0.85為拮抗效應(yīng)。

1.4TUNEL法測(cè)定U2-OS細(xì)胞凋亡 使用熒光素碎片DNA片段檢測(cè)試劑盒(DeadEnd,美國(guó))進(jìn)行TUNEL檢測(cè)。經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗去U2-OS細(xì)胞培養(yǎng)液，4 ℃條件下使用4%甲醛溶液固定25 min，PBS液洗滌5 min×2次。加入0.2% TritonX-100室溫孵育5 min,PBS液洗滌5 min×2次。加入100 μl平衡緩沖液室溫平衡10 min。加入50 μl末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶工作液，37 ℃濕盒內(nèi)避光孵育60 min。加入預(yù)先配置好的SSC溶液洗滌15 min。再次加PBS溶液室溫洗滌5 min×3次。在4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚染液室溫濕盒避光孵育10 min。然后加去離子水室溫洗滌5 min×3次。熒光抗淬滅劑封片，使用熒光顯微鏡(U-REL-T，OLYMPUS)鏡檢。細(xì)胞凋亡率=陽(yáng)性染色細(xì)胞(即凋亡細(xì)胞)/總細(xì)胞×100%。

1.5Caspase-3活性檢測(cè) 按試劑盒提供的對(duì)硝基苯胺(p-nitroaniline，pNA；10 mmol/L)用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋，測(cè)定其405 nm處吸光度(A405值),并作出pNA濃度相當(dāng)于A405值的pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線,依據(jù)pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線定量檢測(cè)Caspase-3。取藥物處理好的細(xì)胞加入裂解液，重懸后冰浴裂解15 min,使用聚氰基丙烯酸正丁酯蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。按照檢測(cè)緩沖液50 μl+待測(cè)樣本40 μl+10 μl Caspase-3顯色底物(2 mmol/L)配置反應(yīng)體系，37 ℃孵育120 min后應(yīng)用酶標(biāo)儀(DNM-9602A)測(cè)定其A405值。樣品中Caspase-3催化產(chǎn)生的pNA產(chǎn)生的吸光度值=樣品孔A405值-空白對(duì)照孔A405值。

1.6Western blot檢測(cè)Caspase-3、Fas、FasL蛋白表達(dá) 使用含有60 g/ml苯甲基磺酰氟的裂解緩沖液提取U2-OS細(xì)胞的總蛋白。使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)100 ℃水浴變性5 min，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后將蛋白從膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。將膜浸在封閉液中4 ℃封閉過(guò)夜。將膜取出放入一抗液中，4 ℃封閉過(guò)夜。PBST洗膜，5 min×4次。將膜轉(zhuǎn)入二抗液中，37 ℃孵育1 h，用洗脫液洗滌3次，前兩次5 min，第三次10 min，然后用鑷子輕輕地將PVDF膜放置于曝光盒里，于暗室內(nèi)壓片并沖印成像。應(yīng)用膠片用凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDoc MP Imaging System，美國(guó)BIO-RAD公司)進(jìn)行掃描及數(shù)據(jù)采集。

2 結(jié)果

2.1PEITC和ADM對(duì)U2-OS細(xì)胞增殖能力的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，PEITC和ADM濃度對(duì)U2-OS細(xì)胞的IC50分別為4.37 μM/ml和6.61 μg/ml。見(jiàn)圖1。與單獨(dú)使用PEITC或ADM處理相比，聯(lián)合使用兩種藥物對(duì)U2-OS細(xì)胞的增殖抑制率更高(P<0.05)。低劑量的PEITC聯(lián)合ADM產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，而高劑量的兩種藥物聯(lián)合產(chǎn)生相加效應(yīng)，見(jiàn)表1。

2.2不同處理組U2-OS細(xì)胞的凋亡情況比較 熒光顯微鏡觀察見(jiàn)較高濃度PEITC、ADM處理組的U2-OS細(xì)胞凋亡數(shù)多于較低濃度組，且低濃度PEITC聯(lián)合ADM處理組的U2-OS細(xì)胞凋亡數(shù)比單獨(dú)使用PEITC或ADM的高濃度處理組更多。見(jiàn)圖2。除ADM(6.61 μg/ml)組與PEITC(4.37 μM/ml)組的U2-OS細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其余不同處理組間U2-OS細(xì)胞的凋亡率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

?ADM干預(yù)處理；?PEITC干預(yù)處理

表1 不同處理組U2-OS細(xì)胞增殖抑制率及Q值比較

藍(lán)色熒光表示正常U2-OS細(xì)胞，綠色熒光表示凋亡細(xì)胞

表2 不同處理組U2-OS細(xì)胞的凋亡率比較

2.3不同處理組Caspase-3活性比較 單因素方差分析結(jié)果顯示，ADM(6.61 μg/ml)組和PEITC(4.37 μM/ml)組的U2-OS細(xì)胞Caspase-3活性顯著高于空白對(duì)照組，ADM(6.61 μg/ml)聯(lián)合PEITC(4.37 μM/ml)處理后，U2-OS細(xì)胞Caspase-3活性較單藥處理組上升。見(jiàn)表3。

表3 不同處理組Caspase-3活性比較

2.4不同處理組Caspase-3、Fas、FasL蛋白表達(dá)水平比較 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,ADM(6.61 μg/ml)+PEITC(4.37 μM/ml)組的Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著高于ADM(6.61 μg/ml)組和PEITC(4.37 μM/ml)處理組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。另外，ADM(6.61 μg/ml)+PEITC(4.37 μM/ml)組的Fas蛋白表達(dá)水平顯著低于PEITC(4.37 μM/ml)處理組(P<0.05)，F(xiàn)asL蛋白表達(dá)水平顯著高于ADM(6.61 μg/ml)組(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表4。

圖3 Western blot檢測(cè)結(jié)果圖

表4 不同處理組Caspase-3、Fas、FasL蛋白表達(dá)水平比較灰度值]

3 討論

3.1骨肉瘤是一種好發(fā)于10～20歲的青少年的原發(fā)性惡性骨腫瘤,常發(fā)生于長(zhǎng)骨干骺端。目前對(duì)于骨肉瘤的療法主要是采用手術(shù)切除腫瘤聯(lián)合化療的方式進(jìn)行治療。然而，骨肉瘤的早期肺轉(zhuǎn)移以及較高的復(fù)發(fā)率也導(dǎo)致了骨肉瘤患者的高病死率和致殘率。根據(jù)《骨肉瘤臨床循證診療指南》[17]的建議，ADM被推薦作為一線化療藥物，盡管其大大地提高了患者的5年生存率及保肢率，但是ADM的耐藥問(wèn)題依然嚴(yán)峻，給臨床治療增加了一定的難度。PEITC是常用的人工合成的抗腫瘤單體,具有良好的抗腫瘤作用。目前，PEITC在肝癌、乳腺癌及骨髓瘤等惡性腫瘤的體外試驗(yàn)中顯示出顯著的抗腫瘤效果，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用明顯[18]。高劑量的ADM可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤耐藥或是對(duì)機(jī)體產(chǎn)生較大的毒副作用，并最終導(dǎo)致治療失敗。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)ADM聯(lián)合PEITC作用于骨肉瘤細(xì)胞系時(shí)，ADM能夠在一個(gè)相對(duì)較低的濃度獲得一個(gè)令人滿意的癌細(xì)胞增殖的抑制效果，這對(duì)指導(dǎo)臨床研究的開(kāi)展有實(shí)際意義。

3.2在本研究中，經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)確定了PEITC和ADM處理U2-OS細(xì)胞系時(shí)的IC50分別為4.37 μM/ml和6.61 μg/ml。并且在藥物濃度較低時(shí)，兩種藥物聯(lián)合表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用，而當(dāng)藥物濃度上升，協(xié)同作用變?nèi)酰瑒t表現(xiàn)出相加作用。但無(wú)論如何，PEITC都能增強(qiáng)ADM對(duì)U2-OS細(xì)胞增殖的抑制作用。ADM可誘導(dǎo)多種類型癌細(xì)胞凋亡[19]，PEITC也對(duì)腫瘤細(xì)胞具有相似的功能效果[20]。本研究結(jié)果顯示，PEITC聯(lián)合ADM處理U2-OS細(xì)胞可獲得比單藥處理更高的凋亡率，考慮可能為PEITC提高了U2-OS細(xì)胞對(duì)ADM凋亡作用的敏感性。

3.3ADM誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡可能是多個(gè)信號(hào)通路共同作用的結(jié)果[21]。例如，ADM通過(guò)Fas介導(dǎo)的凋亡通路而誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡[22]。然而也有研究[23,24]認(rèn)為，ADM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要依賴腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體-TRAIL受體信號(hào)，而并不是通過(guò)FasL、穿孔素、自然殺傷細(xì)胞受體D或血小板和T細(xì)胞活化抗原1進(jìn)行。經(jīng)PEITC和ADM處理的U2-OS細(xì)胞沒(méi)有觀察到FasL表達(dá)增加，且PEITC和ADM聯(lián)合處理的U2-OS細(xì)胞觀察到Fas表達(dá)下降，提示Fas/FasL信號(hào)通路未參與其凋亡過(guò)程。Caspase-3蛋白被稱為死亡蛋白酶,是Caspases家族中最重要的細(xì)胞凋亡執(zhí)行者之一。在蛋白酶級(jí)聯(lián)切割過(guò)程中，Caspase-3蛋白發(fā)揮著重要的作用,一旦Caspase-3蛋白被激活就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[25]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)PEITC和ADM處理后，U2-OS細(xì)胞的Caspase-3蛋白活性和表達(dá)水平顯著增強(qiáng)?；罨腃aspase-3蛋白可引起與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期及DNA修復(fù)相關(guān)基因或蛋白失活,誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡而抑制癌癥的發(fā)生[26]。PEITC和ADM的協(xié)同作用(或是相加作用)可在較低藥物濃度條件下達(dá)到上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)的效果，并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)PEITC的臨床應(yīng)用提供了一定依據(jù)。

綜上所述，PEITC聯(lián)合ADM可在較低藥物濃度條件下有效抑制U2-OS細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞凋亡率，其作用可能與Caspase-3蛋白活性升高和表達(dá)量上調(diào)有關(guān)，這為PEITC聯(lián)合ADM的臨床應(yīng)用提供了參考依據(jù)。