郭鵬豪，廖 康，伍眾文，何宇婷，陳怡麗，劉 敏

侵襲性肺部真菌感染指不包括真菌寄生和過敏所致的支氣管肺部真菌感染,分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種類型[1]。近年來，隨著人口老齡化﹑器官移植免疫抑制劑的使用、腫瘤放化療、造血干細(xì)胞移植、超廣譜抗生素和多種抗生素聯(lián)合應(yīng)用、皮質(zhì)類固醇激素的使用以及各種導(dǎo)管介入治療等，使侵襲性肺部真菌感染的發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。由于肺部真菌感染臨床表現(xiàn)常無特異性，早期診斷困難，且病情易被基礎(chǔ)病掩蓋，造成誤診、漏診而延誤治療。正確、及時(shí)診斷肺部真菌感染依賴于實(shí)驗(yàn)室精準(zhǔn)的檢測(cè)結(jié)果。筆者現(xiàn)對(duì)肺部真菌感染常用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，包括傳統(tǒng)方法(直接鏡檢、真菌培養(yǎng))、血清學(xué)檢測(cè)[G試驗(yàn)、曲霉菌抗原、隱球菌莢膜多糖抗原(cryptococcal polysaccharide capsule antigen,CrAg)、曲霉菌抗體]和核酸檢測(cè)等進(jìn)行介紹。

1 侵襲性肺部真菌感染的流行情況

目前我國(guó)學(xué)者報(bào)道的侵襲性肺部真菌感染的病原體分布具有一定的差異。閆曉培等[2]報(bào)道在非移植患者中最常見的病原體是隱球菌、曲霉菌和毛霉菌。屈晶晶等[3]報(bào)道在非重癥監(jiān)護(hù)室確診肺真菌病患者中的前4位病原體分別為曲霉菌、隱球菌、毛霉菌和組織胞漿菌。北京協(xié)和醫(yī)院一項(xiàng)長(zhǎng)達(dá)15年，針對(duì)187例的肺真菌病組織病理學(xué)的回顧性分析[4]結(jié)果顯示：肺曲霉病85例(45.5%)，肺隱球菌病51例(27.3%)，肺毛霉病6例(3.2%)，肺組織胞漿菌病3例(1.6%)，肺念珠菌病3例(1.6%)，肺孢子菌病2例(1.1%)，不能明確分類37例(19.8%)。筆者所在單位中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院從2019-01～2020-12臨床診斷為侵襲性肺部真菌感染的患者198例，其中以曲霉菌為主，其次為新型隱球菌、馬爾尼菲籃狀菌等，具體分布見圖1。其中馬爾尼菲籃狀菌的分離率高于國(guó)內(nèi)目前的報(bào)道，這與該菌種的流行區(qū)域有關(guān)。

圖1 2019-01～2020-12中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床診斷侵襲性肺部真菌感染患者的病原體分布圖

2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

2.1直接顯微鏡檢查 直接顯微鏡檢查是一種快速、性價(jià)比高的方法。采集痰、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、肺組織等標(biāo)本，通過顯微鏡觀察標(biāo)本中是否存在真菌孢子及菌絲，同時(shí)根據(jù)孢子及菌絲的特點(diǎn)對(duì)于菌種的種屬進(jìn)行初步判定。直接鏡檢結(jié)果也能指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室選擇最適合真菌體外生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件。目前最常用的染色方法包括氫氧化鉀(KOH)濕片、革蘭染色、六胺銀染色、鈣熒光白染色等[5]。KOH濕片法通過對(duì)標(biāo)本中的蛋白質(zhì)成分進(jìn)行消化，留下完整且更加明顯的真菌細(xì)胞壁，從而將標(biāo)本內(nèi)的真菌與其他成分進(jìn)行區(qū)分。六胺銀染色通過將銀離子沉積在胞壁上，把真菌染成黑色輪廓，背景呈淡綠色，較革蘭染色更易識(shí)別且形態(tài)更加清晰，但操作相對(duì)比較復(fù)雜。鈣熒光白染色通過熒光染料非特異地與真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)結(jié)合，在熒光顯微鏡下真菌菌體呈淺藍(lán)或綠色，具有較高的敏感性。熒光抗體染色則可針對(duì)不同真菌種屬進(jìn)行特異性染色，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行消化、富集以后再進(jìn)行相應(yīng)的染色，可提高直接顯微鏡檢查的靈敏度。對(duì)于有條件的實(shí)驗(yàn)室建議開展鈣熒光白染色或者熒光抗體的染色方法，提高檢測(cè)的靈敏度。另外需要注意的是，處理患者標(biāo)本時(shí)應(yīng)采取全面的防護(hù)措施，在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行標(biāo)本的操作。臨床標(biāo)本直接涂片染色時(shí)真菌的顯微鏡下形態(tài)見圖2。

?曲霉菌絲(KOH濕片)；?曲霉菌絲(革蘭染色)；?新型隱球菌(墨汁染色)；?曲霉菌絲(鈣熒光白染色)；?毛霉菌絲(鈣熒光白染色)；?馬爾尼菲籃狀菌孢子(鈣熒光白染色)

2.2組織病理學(xué)檢查 組織病理是診斷真菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)與微生物學(xué)檢查密切結(jié)合[5]。蘇木素-伊紅(HE)染色可用于篩查。如果HE染色后懷疑真菌，則可使用針對(duì)真菌特定結(jié)果的染色方法[碘酸-希夫(PAS)染色、GMS染色等]。PAS染色可使真菌染成鮮紅色，GMS染色也可用于組織病理學(xué)檢查，使真菌呈黑色。

2.3真菌培養(yǎng) 從呼吸道標(biāo)本中培養(yǎng)分離到真菌是診斷侵襲性肺部真菌感染的重要依據(jù)之一。目前已發(fā)表文獻(xiàn)[6～8]顯示真菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率為56.0%～81.0%。對(duì)分離到的真菌可以通過如形態(tài)學(xué)、生化反應(yīng)、質(zhì)譜儀等技術(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定并進(jìn)行藥敏檢測(cè)，從而為臨床抗真菌藥物的選擇提供重要的依據(jù)。當(dāng)懷疑有肺部真菌感染時(shí)，建議至少送檢3個(gè)高質(zhì)量的呼吸道標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)。需要注意的是臨床標(biāo)本中真菌培養(yǎng)陽(yáng)性并不一定代表侵襲性感染，區(qū)分呼吸道定植和侵襲性感染是相當(dāng)困難的[9,10]。當(dāng)標(biāo)本真菌培養(yǎng)的結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，需要結(jié)合其他的檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)估。在臨床表現(xiàn)相符的情況下，從組織或者其他呼吸道標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)菌絲，且從同一標(biāo)本中培養(yǎng)出大量的曲霉(或者從多個(gè)標(biāo)本中檢查出相同的菌種)預(yù)示侵襲性肺曲霉菌病。由于念珠菌可在口腔、呼吸道定植，有學(xué)者[11]認(rèn)為呼吸道標(biāo)本無論單次還是多次陽(yáng)性，無論菌落數(shù)多少，對(duì)診斷均無意義。國(guó)內(nèi)一些學(xué)者[12]則認(rèn)為呼吸道標(biāo)本合并真菌感染存在的危險(xiǎn)因素時(shí)，在排除細(xì)菌感染的前提下，不能忽視多次下呼吸道分離出同一種念珠菌對(duì)診斷的價(jià)值。侵襲性肺部真菌感染常見病原體的菌落形態(tài)見圖3。

?煙曲霉(沙氏平板，28 ℃培養(yǎng)3 d)；?新型隱球菌(沙氏平板，28 ℃培養(yǎng)5 d)；?馬爾尼菲籃狀菌(沙氏平板，28 ℃培養(yǎng)5 d)；?根霉菌(沙氏平板，28 ℃培養(yǎng)2 d)

2.4血清學(xué)檢測(cè)

2.4.1 1，3-β-D葡聚糖檢測(cè)(G試驗(yàn)) 1，3-β-D葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的重要組成成分，除隱球菌屬、接合菌以外的大部分真菌都可以通過G試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，該試驗(yàn)被歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組和美國(guó)國(guó)立變態(tài)反應(yīng)和感染病研究院真菌病研究組(European Organization for the Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group，EORTC/MSG)共識(shí)納入為侵襲性真菌感染診斷的間接微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)之一[13]。血清G試驗(yàn)被推薦為侵襲性真菌感染的篩選試驗(yàn)，但是陽(yáng)性結(jié)果并不能明確是哪一種特定真菌的感染。該試驗(yàn)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值隨著患者群體的不同而有差異。多次結(jié)果陽(yáng)性或者檢測(cè)結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過陽(yáng)性閾值時(shí)，陽(yáng)性結(jié)果的置信度增加[14]；重復(fù)檢測(cè)的陰性結(jié)果具有較好的陰性預(yù)測(cè)值。由于1，3-β-D-葡聚糖沒有國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，不同廠家的試劑盒均需要使用自己的參考范圍進(jìn)行結(jié)果評(píng)價(jià)[5]。另外，如透析用纖維素膜、免疫球蛋白、白蛋白、手術(shù)患者大量紗布暴露等可引起G試驗(yàn)出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果[15]。

2.4.2 CrAg檢測(cè) CrAg檢測(cè)是一種簡(jiǎn)單有效、創(chuàng)傷小、靈敏度和特異度較高的診斷肺隱球菌病的技術(shù)，在肺隱球菌病的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷中起到重要作用。莢膜多糖在菌體生長(zhǎng)和繁殖過程中不斷分泌到胞外，可以作為隱球菌感染的診斷依據(jù)。世界衛(wèi)生組織建議當(dāng)CD4細(xì)胞<100個(gè)/μl時(shí)需監(jiān)測(cè)血清CrAg[16]，若血清CrAg陽(yáng)性時(shí)，需對(duì)抗原的滴度進(jìn)行定量檢測(cè)?？乖味鹊慕档褪请[球菌感染治療有效的指標(biāo)。然而，抗原滴度有可能在非艾滋病患者治療的初期下降，但在隱球菌完全清除以后一直保持較高的滴度水平[17]。CrAg檢測(cè)方法包括乳膠凝集法、酶聯(lián)免疫法和免疫側(cè)向?qū)游龇?lateral flow immunochromatographic assays，LFA)。目前美國(guó)IMMY公司的LFA可通過血清、血漿、腦脊液標(biāo)本檢測(cè)新型隱球菌和格特隱球菌，其檢測(cè)靈敏度和特異度在血清標(biāo)本中分別為98%和100%[18]。與乳膠凝集法和酶聯(lián)免疫法相比，LFA的靈敏度更高，同時(shí)具有廉價(jià)、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。白吉利地霉(Geotrichum beigelii)可導(dǎo)致假陽(yáng)性的結(jié)果，而假陰性結(jié)果可能由于抗原濃度低或者高濃度(前帶效應(yīng))所引起。

2.4.3 曲霉菌抗原檢測(cè) 曲霉菌抗原的檢測(cè)成分是半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)。GM是曲霉細(xì)胞壁上主要的多糖成分，其可在菌絲生長(zhǎng)的過程中被釋放出來。該試驗(yàn)被EORTC/MSG納入免疫抑制患者中侵襲性曲霉菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。GM試驗(yàn)可采用血清、BALF、腦脊液標(biāo)本，其診斷效能與基礎(chǔ)人群、是否接受預(yù)防、診斷試劑等因素相關(guān)。血清GM在粒細(xì)胞缺乏的患者中其靈敏度顯著高于非粒細(xì)胞缺乏的患者。血清GM單個(gè)樣本陽(yáng)性(GM結(jié)果≥0.7)或者兩個(gè)樣本≥0.5被認(rèn)為有診斷價(jià)值[19]。雖然BALF GM在臨床應(yīng)用中面臨標(biāo)準(zhǔn)化的問題，但是目前的研究認(rèn)為在侵襲性肺部真菌感染的診斷中BALF GM比血清GM更敏感[20]。對(duì)于BALF GM的臨界值在不同的文獻(xiàn)中有不同的推薦，如Zou等[21]建議為1.0，而Heng等[22]建議為1.5。需要注意的是抗真菌治療可顯著降低血清GM試驗(yàn)的靈敏度[23]。部分β內(nèi)酰胺類抗生素(如哌拉西林-他唑巴坦)、新生兒腸道內(nèi)雙歧桿菌定植、攝入含有GM的食物(如谷類食物和牛奶)以及一些非曲霉菌的菌種(如馬爾尼菲籃狀菌、白地霉、無綠藻菌、組織胞漿菌)會(huì)引起GM結(jié)果的假陽(yáng)性。另外建議在治療的過程中對(duì)GM進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，評(píng)估治療的效果。若治療期間，結(jié)果升高預(yù)示預(yù)后較差。但是，結(jié)果轉(zhuǎn)陰，不能作為結(jié)束抗真菌治療的孤立指標(biāo)，應(yīng)該結(jié)合影像、臨床等綜合評(píng)估。

2.4.4 曲霉菌抗體檢測(cè) 曲霉IgG抗體是機(jī)體針對(duì)曲霉菌感染產(chǎn)生的特異性抗體。血清曲霉IgG抗體水平升高，通常提示曲霉菌感染。研究[24]顯示慢性肺曲霉病(chronic pulmonary aspergillosis，CPA)患者中只有26.0%曲霉培養(yǎng)陽(yáng)性，但99.0%的CPA患者存在曲霉菌特異性IgG升高。北京一項(xiàng)研究[25]指出，診斷CPA的曲霉特異性IgG(丹娜)的Cut-off值為89.3 AU/ml時(shí)，靈敏度和特異度分別為78.6%和94.4%。此外，曲霉IgG抗體檢測(cè)不僅對(duì)肺曲霉病的早期臨床診斷具有重要意義，其血清水平的變化能夠直觀地反映陽(yáng)性患者抗真菌治療的療效[26]。2016年，美國(guó)傳染病學(xué)會(huì)(Infectious Diseases Society of America，IDSA)和歐洲臨床微生物學(xué)及傳染病學(xué)會(huì)(European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases，ESCMID)與歐洲呼吸學(xué)會(huì)(European Respiratory Society，ERS)合作，發(fā)布了CPA診斷指南[27,28]。這兩項(xiàng)指南均建議將曲霉IgG抗體檢測(cè)作為診斷CPA的關(guān)鍵指標(biāo)。

2.4.5 核酸檢測(cè) 應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)真菌核酸相比傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有更高的敏感性。采用通用引物或特異性引物的設(shè)計(jì)既可以發(fā)現(xiàn)常見致病真菌(曲霉菌、肺孢子菌),也可以發(fā)現(xiàn)少見或罕見真菌。以real-time PCR及相關(guān)技術(shù)為代表的分子診斷,已逐步成為感染性疾病診斷的重要方法，能提供更加快速的診斷，對(duì)于提早開始抗真菌治療、改善患者預(yù)后及降低病死率有重要意義。PCR技術(shù)檢測(cè)BALF標(biāo)本用于輔助診斷侵襲性肺曲霉菌病具有很好的潛力[29，30]。以下三種情況均可作為診斷侵襲性真菌病的微生物學(xué)證據(jù)：(1)血漿、血清或全血連續(xù)2次或以上PCR檢測(cè)陽(yáng)性；(2)BALF 2次或以上重復(fù)PCR檢測(cè)陽(yáng)性；(3)至少1次血漿、血清或全血PCR檢測(cè)陽(yáng)性和1次BALF PCR陽(yáng)性。另外需要強(qiáng)調(diào)的是，實(shí)驗(yàn)室必須對(duì)標(biāo)本處理、保存、DNA提取和檢測(cè)等全程標(biāo)準(zhǔn)化，并采取嚴(yán)格的防污染措施。

2.4.6 宏基因組測(cè)序(metagenomics next generation sequencing，mNGS) mNGS是一種可以直接從患者標(biāo)本中進(jìn)行泛核酸檢測(cè)的方法，允許無差別檢測(cè)所有微生物(如細(xì)菌、病毒、寄生蟲和真菌)、抗體、毒力因子，甚至宿主生物標(biāo)志物等[31]。對(duì)于呼吸道感染患者，若3 d內(nèi)未通過傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查獲得明確的病原學(xué)依據(jù)且經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療無效，推薦留取呼吸道標(biāo)本進(jìn)行mNGS檢測(cè)[32]。肺組織mNGS對(duì)真菌感染的靈敏度為57.1%，特異度為61.5%；對(duì)真菌的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為44.4%，陰性預(yù)測(cè)值為72.7%[33]。標(biāo)本的取樣不規(guī)范，以及真菌細(xì)胞壁厚導(dǎo)致的DNA提取效率低，對(duì)mNGS在真菌檢測(cè)中的靈敏度造成影響。對(duì)于呼吸道感染，mNGS在細(xì)菌、真菌等病原體的檢測(cè)中尚不能準(zhǔn)確判斷菌群定植或感染狀態(tài)，仍需依賴臨床醫(yī)師結(jié)合患者病情進(jìn)行進(jìn)一步分析[32]。綜上，隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，以及更多的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和評(píng)估，在未來盡管mNGS不太可能完全取代傳統(tǒng)的病原體鑒定和抗生素敏感性檢測(cè)，但必將為侵襲性肺部真菌感染提供更強(qiáng)的診斷能力。侵襲性肺部真菌感染診斷中不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的特點(diǎn)見表1。

表1 侵襲性肺部真菌感染診斷中不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的特點(diǎn)

續(xù)表1

3 結(jié)語(yǔ)

精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室檢查是實(shí)現(xiàn)侵襲性肺部真菌感染精準(zhǔn)診療的前提和基礎(chǔ)。循證醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)表明準(zhǔn)確、早期的病原真菌實(shí)驗(yàn)室診斷，有利于盡早開始靶向性抗真菌治療，對(duì)改善患者預(yù)后、降低病死率有顯著作用。目前實(shí)驗(yàn)室除了傳統(tǒng)的真菌涂片及培養(yǎng)等傳統(tǒng)的方法外，血清學(xué)檢測(cè)在臨床的應(yīng)用越來越廣泛，標(biāo)本中真菌的核酸檢測(cè)在臨床也逐漸開始應(yīng)用。充分了解每種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)以及檢測(cè)性能，可以更好地幫助診斷侵襲性肺部真菌感染。在臨床工作中將傳統(tǒng)的檢測(cè)方法與血清學(xué)檢測(cè)、核酸檢測(cè)聯(lián)合應(yīng)用可顯著提高侵襲性肺部真菌感染的檢測(cè)靈敏度，更好地區(qū)分感染和定植，從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的診斷和治療，改善患者的預(yù)后。