程璧瑄，于 超 ，周利君，蔡珩瑜，羅 樂，潘會堂，張啟翔

(1.花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 100083；2.國家花卉工程技術(shù)研究中心，北京 100083；3.城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗室，北京 100083；4.北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，北京 100083)

薔薇屬(Rosaspp.)是世界最著名的觀賞植物類群之一。全屬約200 種植物，產(chǎn)自中國的薔薇屬植物有82 種[1]。月季組的物種是薔薇屬下的重要研究材料。月季組中包含了月季花(R.chinensis)、香水月季(R.odorata)和亮葉月季(R.lucidissima)，在薔薇屬中具有極高的育種價值。香水月季自然分布于中國云南[1]，其對現(xiàn)代月季的形成起到了關(guān)鍵作用。目前對于香水月季的記載主要依據(jù)《中國植物志》，即3 個變種：大花香水月季(R.odoratavar.gigantea)、橘黃香水月季(R.odoratavar.pseudlindica)和粉紅香水月季(R.odoratavar.erubescens)[1]。然而野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)：香水月季野生居群的表型變異極為豐富，且缺乏深入研究。

花粉具有個體小、質(zhì)量輕、產(chǎn)量大和易于保存等特點(diǎn)[2]。花粉的形態(tài)特征相對穩(wěn)定，是研究植物分類、系統(tǒng)演化的重要依據(jù)之一，在觀賞植物分類和親緣關(guān)系研究中起到重要的作用[3-7]，也是探討種和品種演化的重要依據(jù)[8-13]。

國內(nèi)外對于薔薇屬的孢粉學(xué)有一定的研究[14-16]。馮立國等[17]研究了野生玫瑰及玫瑰品種的花粉形態(tài)及其演化趨勢；白錦榮[14]對薔薇野生種與中國傳統(tǒng)月季品種花粉形態(tài)做過初步研究，依據(jù)花粉外壁紋飾的差異對材料進(jìn)行聚類分析，根據(jù)孔穴密度可以區(qū)分表型相似的月季品種月月粉和月月紅，并探討了中國傳統(tǒng)月季的品種起源和演化；羅樂等[18]對29 個薔薇屬種類的花粉進(jìn)行分析，探討了薔薇屬的亞屬及組間的親緣關(guān)系，為薔薇屬植物系統(tǒng)進(jìn)化研究提供了孢粉學(xué)依據(jù)。

本研究對薔薇屬月季組的香水月季和月季花的25 份材料進(jìn)行花粉形態(tài)學(xué)研究，包括野生資源和品種資源，探討物種之間的親緣關(guān)系，為相關(guān)的育種工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

選取的21 份香水月季材料于2012—2017 年間采自中國云南省的18 個地區(qū)，采樣地及采樣地經(jīng)緯度、海拔如表1 所示。同時以中國四川省的2 份單瓣月季花(R.chinensisvar.spontanea)(13 號和22 號)、采自重慶的野生月季花(24 號)以及月月粉(R.chinensis‘Old Blush’)(25 號)為對照材料進(jìn)行比較分析。

表1 研究材料采樣地地理信息Tab.1 Geographic location of selected sites of the materials

1.2 研究方法

取尚未開放的花蕾，剝離花藥后放在干燥通風(fēng)的室內(nèi)自然風(fēng)干。散粉后裝入有硅膠顆粒的離心管中并用棉花封口。試驗前用烘干機(jī)在60 ℃條件下烘干至花粉達(dá)到絕干狀態(tài)，避免因花粉粒中的水分影響拍攝[19]。真空鍍膜后用掃描電子顯微鏡(日立S-3400N II)和場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SU8010)掃描照相。分別于200～500× (群體)、2 000×、3 000× (個體、赤道面觀、極面觀)和8 000× (外壁紋飾)下觀察并拍照。試驗數(shù)據(jù)測量分析所用軟件為AutoCAD 和SPSS 21.0，隨機(jī)選取照片中狀態(tài)良好的花粉，用AutoCAD 測量極軸長(P)、赤道軸長(E)、孔穴直徑、條嵴間距、條嵴寬度、孔穴密度、條嵴密度、萌發(fā)溝長及萌發(fā)溝寬，每份材料的每種性狀測量30 個樣本數(shù)據(jù)并取平均值。另外觀察并記錄各花粉的赤道面觀、極面觀以及外壁紋飾的類型。

根據(jù)觀測記錄結(jié)果，選取12 個性狀，其中數(shù)量性狀10 個，定性指標(biāo)2 個，利用SPSS 21.0軟件將所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行指標(biāo)化后，使用最遠(yuǎn)鄰元素法對其進(jìn)行聚類分析，獲得孢粉形態(tài)學(xué)性狀聚類圖，并對其結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果與分析中的專業(yè)術(shù)語均參照文獻(xiàn)[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉外形

由掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果(圖1～5)可知：研究觀察的全部25 份供試材料的花粉均為單粒、等極和輻射對稱。根據(jù)ERDTMAN[20]提出的NPC 分類系統(tǒng)，所有供試材料的花粉均屬于N3P4C5型花粉。

圖1 1～5 號供試材料花粉形態(tài)Fig.1 The pollen morphologies of No.1-5 materials of R. sect.chinenses

圖2 6～10 號供試材料花粉形態(tài)Fig.2 The pollen morphologies of No.6-10 materials of R. sect.chinenses

由表2 所示：研究觀察的大部分材料的花粉為超長球形(P/E值＞2)，僅有少數(shù)幾份香水月季資源花粉為長球形(P/E值≤2)。所有花粉的極面觀均為具三孔溝的三裂圓形；赤道面呈橢圓形或矩圓形，可見1～2 條萌發(fā)溝。萌發(fā)溝兩端幾乎達(dá)到兩極，溝長范圍在31.09～38.92 μm，而溝寬差異較大，范圍在0.24～1.39 μm。具體花粉形態(tài)特征見表2。

2.2 花粉大小

花粉粒大小中等，極軸長(P)范圍在36.06～42.81 μm 之間，赤道軸長(E)范圍在16.39～20.07 μm 之間，P/E值為1.98～2.35。其中最大花粉粒來自14 號材料，P×E的平均值為42.81 μm×19.83 μm；8 號香水月季花粉的P×E平均值最小，為36.29 μm×16.66 μm。

2.3 外壁紋飾類型

供試材料的花粉外壁紋飾主要為孔穴—條紋型，而不同種類的孔穴和條紋具不同特點(diǎn)，可進(jìn)一步細(xì)分為不同的類型。

2.3.1 條紋

條紋紋飾的主要區(qū)別在于其條嵴寬度和間距，條紋的深淺、密度以及條嵴走向。從表2 可以看出：花粉的條嵴寬度在0.14～0.24 μm，間距則在0.09～0.28 μm。其中條嵴密度最大的為3 號香水月季，密度最小的為18 號香水月季。條嵴走向也是判斷花粉形態(tài)差異的一個重要因素，結(jié)果分析大致可分為三類：第1 類是條紋從兩極起始，幾乎與兩極平行，如20 和23 號材料(圖5)；第2 類是條紋幾乎與兩極垂直，13 和14 號材料屬于此類(圖3)；第3 類是條紋在兩極處與其近似垂直，在赤道面處則與兩極幾乎平行，此種類型的花粉最多，涵蓋了大部分供試材料。此外，本研究所測定的25 份材料的花粉均有清晰深刻的條紋和紋理，因此在條紋深度方面，供試材料間不存在較大差異。

圖3 11～15 號供試材料花粉形態(tài)Fig.3 The pollen morphologies of No.11-15 materials of R. sect.chinenses

2.3.2 孔穴

孔穴的區(qū)別主要在于其孔徑大小、密度、穿透力以及分布的差別上。25 份香水月季材料中，孔穴的形狀多為圓形或近圓形。不同材料的孔穴穿透力具有一定的差別，可大致分為兩類：一類是孔穴均較為深刻，具有一定的穿透力，此種孔穴幾乎分布在花粉的各個位置；另一類是孔穴深淺不一，很多孔穴僅在外壁表面形成凹槽而無法深入，此種現(xiàn)象多發(fā)生在條紋細(xì)密的紋飾中，同時孔穴多分布在兩極或萌發(fā)溝處。由表2 可見：不同材料的孔穴密度具有很大差異，而其中孔穴的分布也存在著不同，孔穴密度最大的17 號香水月季的孔穴遍布整個花粉粒(圖4)，而密度最小的12 號香水月季的孔穴多分布于萌發(fā)溝邊和兩極處，同時其條紋密集，其孔穴也深淺不一(圖3)。

2.4 聚類分析

圖4 16～20 號供試材料花粉形態(tài)Fig.4 The pollen morphologies of No.16-20 materials of R. sect.chinenses

采用最遠(yuǎn)鄰元素法對孢粉學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。由圖6 所示：所有材料整體被聚為4 個類群。聚類結(jié)果將2 份月季花資源(24、25 號)和大多數(shù)香水月季資源歸在第I 類群，其中21 號資源與野生月季花(24 號)距離很近，15 號資源與月月粉(25 號)距離很近，此結(jié)果與課題組對于供試材料在表型水平的聚類分析一致，推測這2 份資源在遺傳關(guān)系上與月季花類資源更為接近。第II 類群中包含了3 份香水月季資源，這3 份資源的花粉均為超長球形，且表型性狀也十分相似，均為重瓣香水月季。在基于表型性狀的聚類分析中，這3 份也被一同聚在1 個類群中且遺傳距離十分相近。第Ⅲ類群中包含了4 份單瓣資源(1、2、13 和22 號)，結(jié)果將2 份野生單瓣月季花資源一同聚在這一類群中。但在第Ⅲ類群中，香水月季資源與月季花資源沒有完全分開。本次聚類結(jié)果將大花香水月季(3 號)和粉紅香水月季(6 號)同聚為第Ⅳ類群，兩者均為《中國植物志》中所記載的香水月季變種，外壁條紋走向均為復(fù)合性狀，在兩極處垂直于極面，越靠近赤道面處的條嵴越幾乎與極面平行，結(jié)果表示兩者遺傳關(guān)系很近。

3 討論

3.1 花粉演化趨勢

圖5 21～25 號供試材料花粉形態(tài)Fig.5 The pollen morphologies of No.21-25 materials of R. sect.chinenses

ERDTMAN[20]認(rèn)為：被子植物花粉外壁紋飾的演化由無結(jié)構(gòu)層(光滑)向穿孔(孔穴)發(fā)展，再由穿孔繼續(xù)演化成條紋類型。WALKER[21]對毛茛科類植物花粉的主要演化趨勢進(jìn)行分析，認(rèn)為在進(jìn)化上花粉形態(tài)的演變規(guī)律為由大到小、由球形到超長球形，外壁紋飾從無穿孔覆蓋層到穿孔覆蓋層。WODEHOUSE[22]分析花粉功能和進(jìn)化的關(guān)系時指出：花粉越長，其體積與表面積之比越小，調(diào)節(jié)功能便越強(qiáng)，表明花粉越進(jìn)化。周麗華等[23]研究認(rèn)為：穴狀紋飾是薔薇科花粉中較為原始的類型，而條紋—網(wǎng)狀和條紋狀紋飾依次是比較進(jìn)化的類型。因此，花粉的大小、性狀和外壁紋飾上條嵴的有無、寬窄以及間距等都可以在一定層面上反映出被子植物的進(jìn)化程度。LUO 等[24]對新疆疏花薔薇的表型變異和孢粉形態(tài)進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)疏花薔薇不同變種的花粉粒形狀及外壁紋飾差異較大，表明花粉形態(tài)與表型性狀具有一定的相關(guān)性。本研究顯示：不同采集地的香水月季的花粉在條紋走向、條嵴密度、條嵴寬度和孔穴密度等方面存在差異，很可能這些細(xì)微的差異使得香水月季產(chǎn)生了野外豐富的花色及重瓣性等變異。對供試香水月季資源的花粉進(jìn)行比較可以看出：在單瓣香水月季材料中，花粉的P/E值普遍較小，部分為長球形；而重瓣的香水月季資源花粉P/E值較大，均為超長球形。因此，單瓣較重瓣的香水月季可能更為原始，這也反映了花粉的進(jìn)化程度與植物形態(tài)分類上的聯(lián)系。

根據(jù)前人的研究[18]可以得知：月月粉在月季組中的遺傳水平較為進(jìn)化，對比月月粉的孢粉學(xué)信息可知，大花香水月季(R.odoratavar.gigantea)和粉紅香水月季(R.odoratavar.erubescens)較月月粉更為進(jìn)化。兩者都具有超長球形進(jìn)化趨勢；單位面積內(nèi)的條嵴和孔穴數(shù)量也更多，花粉外壁紋飾的圖案更為復(fù)雜，其條紋為復(fù)合型走勢，而孔穴則深淺不一，整個外壁顯示從穿孔型向條紋型演化的趨勢。

與薔薇屬孢粉學(xué)相關(guān)的桂味組、芹葉組和合柱組結(jié)果相比[18]，本研究的月季組種類的花粉形態(tài)大部分為超長球形。前人研究中芹葉組植物的花粉普遍孔穴較少甚至沒有孔穴，桂味組植物的孔穴密度也較小[18]，白錦榮[14]認(rèn)為芹葉組可能為薔薇屬較原始的類型，桂味組次之，合柱組和月季組均較為進(jìn)化且比較相近。這與本研究結(jié)果相符，并進(jìn)一步證明了香水月季是薔薇屬中一個較為進(jìn)化的物種。

圖6 基于12 個花粉形態(tài)性狀的25 份供試材料聚類分析Fig.6 The cluster analysis of 25 materials based on 12 pollen morphology traits

3.2 遺傳關(guān)系探討

聚類結(jié)果表明：部分香水月季資源與月月粉、單瓣月季花聚在同一類群，參考表型研究結(jié)果，可將15 與21 號歸為月季花類資源。在表型性狀的聚類結(jié)果中，單瓣月季花與月月粉被聚在同一類群[27]，但本研究結(jié)果卻將兩者分開。在基于SSR 分子標(biāo)記和單拷貝基因的薔薇屬植物系統(tǒng)發(fā)育研究中，用SSR 構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹與本研究聚類結(jié)果相似，即將大花香水月季與粉紅香水月季單獨(dú)聚在一起，同時將月月粉與單瓣香水月季資源分開，而基于GAPDH基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹卻有著相反的結(jié)果[25]。單瓣月季花被認(rèn)為是月月粉品種起源的重要親本，而香水月季也與參與了月月粉的起源[26-27]。綜上可知，月月粉、單瓣月季花和香水月季之間有著復(fù)雜的遺傳相關(guān)性。

MENG 等[28]在基于葉綠體基因及單拷貝核基因的分析認(rèn)為，部分重瓣的香水月季資源是月季花和大花香水月季的后代。推測在本研究中，部分香水月季資源與月季花類群遺傳關(guān)系很近，因此沒有被完全分開。

4 結(jié)論

本研究中供試的25 份香水月季和月季花花粉均為單?；ǚ?，呈長球形或超長球形(P/E在1.98～2.35 之間)，大小為(36.06～42.81) μm×(16.39～20.07) μm。萌發(fā)孔三孔溝，外壁紋飾均為孔穴—條紋型，覆蓋層具穿孔。不同種類之間花粉的外壁紋飾在條紋走向和孔穴穿透等性狀方面有所差異。聚類分析將供試材料劃分為4 個類群。本研究認(rèn)為：單瓣月季花是薔薇屬中較為原始的物種，而香水月季是薔薇屬中1 個較為進(jìn)化的物種。薔薇屬內(nèi)親緣關(guān)系十分復(fù)雜，因此還需結(jié)合表型與分子水平的研究結(jié)果進(jìn)行更為全面的分析探究。