王 迪， 王志棟， 吳 梟， 牛春艷， 董蓮華， 戴新華， 高運華

(中國計量科學(xué)研究院前沿中心，北京100029)

1 引 言

當(dāng)前新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)對全球公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重的威脅[1～5]。這種傳染病于2020年初被大量發(fā)現(xiàn)，我國科學(xué)家在短時間內(nèi)從患者體內(nèi)分離出SARS-CoV-2病毒并進(jìn)行了基因組測序，于2020年1月12日向世衛(wèi)組織提供其基因組序列信息[6,7]。研究發(fā)現(xiàn)該病毒為一種β屬的冠狀病毒，遺傳物質(zhì)為線性單股正鏈的RNA。SARS-CoV-2基因組序列結(jié)構(gòu)顯示該基因組約29～30 kb，由12個蛋白編碼區(qū)/開放讀碼框組成，其基因特征與SARS-CoV和MERS-CoV有一定區(qū)別，與蝙蝠SARS樣冠狀病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性約為80%[8,9]。

目前對SARS-CoV-2感染患者尚無特定的治療方法，及時篩查、早期診斷是緩解病情和阻止疫情進(jìn)一步擴(kuò)散的關(guān)鍵[10～13]。以“熒光定量PCR”為代表的核酸檢測方法因高靈敏度、高特異性成為新冠病毒診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[14～16]。目前國內(nèi)研發(fā)生產(chǎn)SARS-CoV-2核酸檢測試劑的企業(yè)就有100家以上，檢測的靶基因主要為ORF1ab和N基因。然而據(jù)報道，采取熒光定量PCR方法陽性檢出率較低。正如王辰院士所說：“并不是所有的病患都能檢測出核酸陽性”。盡管多個因素會影響最終的檢測結(jié)果，如樣本采集和保存、病毒變異、儀器性能和人員操作等，但部分SARS-CoV-2熒光定量PCR試劑的質(zhì)量問題也很可能是造成“假陰性”的重要原因。因此研制定值準(zhǔn)確、穩(wěn)定可靠的新冠病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，加強(qiáng)對相關(guān)核酸檢測試劑的驗證評價和實驗室的質(zhì)量控制尤為重要。

本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基于滅活的人源SARS-CoV-2病毒的基因組RNA樣本，通過數(shù)字PCR方法對E、ORF1ab和N基因拷貝數(shù)濃度值進(jìn)行了確定，并進(jìn)行了其均勻性和穩(wěn)定性驗證。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)涵蓋了新冠病毒所有特征基因的全部序列，已用于新型冠狀病毒核酸檢測方法開發(fā)、相關(guān)試劑驗證評價以及檢測實驗室質(zhì)量控制和測量結(jié)果的量值溯源等工作。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

候選物為人源高度純化的SARS-CoV-2病毒基因組RNA，RNA保存液和酵母RNA購自美國Thermo Fisher公司，引物和探針合成自上海Invitrogen生物技術(shù)公司，一步法反轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR試劑盒(One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes)購自美國Biorad公司。

2.2 儀器與設(shè)備

QX200數(shù)字PCR儀，購自美國Biorad公司；Light Cycle ?480-II熒光定量PCR儀，購自德國Roche公司；ABI QuantStudio 12 K Flex熒光定量PCR儀，購自美國Thermo Fisher公司；臺式離心機(jī)和Milli-Q Advantage純水儀，購自德國Millipore公司；CP225D電子天平，購自Sartorius公司。

2.3 方法

2.3.1 數(shù)字PCR定值方法

引物及探針序列采用世界衛(wèi)生組織(WHO)和中國疾病預(yù)防控制中心(CDC)公布的序列。對探針濃度及PCR擴(kuò)增溫度進(jìn)行了篩選優(yōu)化，確定的擴(kuò)增條件如下：45 ℃ 10 min，95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，40個循環(huán)；98 ℃ 10 min。具體序列參考WHO和中國CDC公布的SARS-CoV-2熒光定量PCR檢測推薦的序列，見表1。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)貯存溶液目標(biāo)基因拷貝數(shù)濃度的初步確定

取1 μL基因組RNA貯存溶液，用RNA存儲緩沖液，進(jìn)行10×梯度稀釋，用數(shù)字PCR方法進(jìn)行初步檢驗，確定貯存溶液的初始濃度和稀釋比例。

表1 數(shù)字PCR的引物和探針Tab.1 Primers and probes used for digital PCR

2)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制

綜合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選材料的數(shù)量、濃度、數(shù)字PCR方法的線性范圍，以及與實時熒光定量PCR方法的匹配性等因素，確定配制約103copy/μL和 102copy/μL兩個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

取適量基因組RNA貯存溶液，加入設(shè)定比例數(shù)量的RNA存儲緩沖液(內(nèi)含約1 mg/mL的酵母RNA)，在冰水浴中充分震蕩，充分混合均勻，配制成設(shè)定濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。然后在生物安全柜中分裝到0.5 mL無RNA酶的凍存管中，每管50 μL。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗

按照國家計量技術(shù)規(guī)范JJF 1343—2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》中對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性評估的技術(shù)要求，從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分裝的初期、中期、末期隨機(jī)抽取10管SARS-CoV-2基因組RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，選擇最小取樣量為5 μL，采用數(shù)字PCR方法進(jìn)行均勻性測定。每瓶重復(fù)檢測3次，并采用方差分析法(F檢驗)對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性檢驗[17]。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性考察

由于應(yīng)急所需，此標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)當(dāng)前只開展了短期穩(wěn)定性考察。儲存溫度為4 ℃，分別在第0日、1日、3日、5日取樣。每次每個儲存溫度隨機(jī)選取2個樣本，每個樣本重復(fù)測量3測，采用數(shù)字PCR方法檢測E、ORF1ab、N三個基因的濃度。

將特性量值(Y)與時間(X)繪制曲線并擬合，擬合直線斜率b1和斜率的不確定度s(b1)分別為：

(1)

(2)

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值

采用一步法反轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR方法對兩種濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值。每種濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)抽取10個單元，每個單元取樣5 μL，按照第2.2節(jié)中確定的檢測方法分別對3種基因進(jìn)行定量檢測，每個單元重復(fù)測量3次。

3 結(jié)果與討論

3.1 均勻性檢驗

3.2 穩(wěn)定性考察

按第2.3.4節(jié)中的方法，監(jiān)測在4 ℃條件下標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)E、ORF1ab和N基因濃度隨時間的變化，來評價標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的短期穩(wěn)定性，結(jié)果如圖1。

表2 兩種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗Tab.2 Homogeneity of the two types of reference materials

圖1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的短期穩(wěn)定性考察(4 ℃保存)Fig.1 Short-term stability of the reference material stored at 4 ℃

根據(jù)圖1的擬合直線，計算斜率b1和s(b1)，并查表得到置信水平0.95的t分布因子。結(jié)果如表3所示，3個基因均滿足|b1|

表3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性測試結(jié)果Tab.3 Short-term stability result of the reference material

由于應(yīng)急所需，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)暫時未進(jìn)行長期穩(wěn)定性考察。但是根據(jù)CCQM P199 HIV-1 RNA比對中主導(dǎo)實驗室提供的長期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)(可穩(wěn)定保存8個月)，可以預(yù)測本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性，我們將會對該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長期穩(wěn)定性持續(xù)進(jìn)行監(jiān)測。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值

按第2.3.1節(jié)中確定的檢測方法，采用一步法逆轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR分別對E、ORF1ab和N基因進(jìn)行定量檢測。利用格拉布朗法和夏皮羅-威爾克法進(jìn)行離群值檢驗和正態(tài)性分析后，所有定值數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，定值數(shù)據(jù)沒有異常值，數(shù)據(jù)均保留(見表4和表5)，其中：SD表示標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD表示相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，在低濃度和高濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中，3個基因的RNA濃度是不同的，其中N基因拷貝數(shù)最高，E基因居中，ORF1ab基因拷貝數(shù)最低。

表4 低濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度的數(shù)字PCR定量結(jié)果

表5 高濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度的數(shù)字PCR定值結(jié)果

3.4 定值結(jié)果的不確定度評定

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的總不確定度由3個部分組成[18～20]。第1部分是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方法的不確定度；第2部分是物質(zhì)不均勻性所引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度；第3部分是物質(zhì)在有效期內(nèi)的不穩(wěn)定性所引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。表6為不確定度評定結(jié)果，合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(3)

式中：ucr為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方法的相對不確定度；ubbr為物質(zhì)不均勻性所引起的相對不確定度；usr為物質(zhì)在有效期內(nèi)的不穩(wěn)定性所引起的相對不確定度。

(1)定值方法的不確定度包括了A類不確定度和B類不確定度。根據(jù)2種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果數(shù)據(jù)和測量次數(shù)，計算出每個標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的A類不確定度ucr(A)；B類不確定度ucr(B)主要是儀器采集熒光信號時產(chǎn)生的不確定度(因儀器按照規(guī)定定期維護(hù)，該項忽略不計)和微滴體積引入的不確定度(0.8% )[21,22]。

(2)均勻性檢驗結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在管間具有良好的均勻性。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)拷貝數(shù)值這一特性量值的均勻性引入的不確定度采用式(4)進(jìn)行計算：

(4)

式中ν為組內(nèi)自由度。

(3)拷貝數(shù)濃度穩(wěn)定性的不確定度貢獻(xiàn)采用公式：us=s(b1)·X進(jìn)行計算。

表6 不確定度評定Tab.6 Evaluation of measurement uncertainty (%)

3.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評審和應(yīng)用

全國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理委員會組織技術(shù)專家對研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了技術(shù)評審，并報送國家市場監(jiān)管總局批準(zhǔn)，獲得了國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，編號分別為GBW(E)091098和GBW(E)091099。

應(yīng)用研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，先后完成了對9種SARS-CoV-2病毒qRT-PCR檢測試劑盒的性能評價。結(jié)果表明盡管不同試劑盒選擇的靶基因檢測區(qū)段存在差異，但以該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為模板，這9種檢測試劑盒均能擴(kuò)增產(chǎn)生目標(biāo)核酸片段，成功完成了性能評價工作。這說明該基因組RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有普遍適用性，可廣泛應(yīng)用于各類新冠相關(guān)核酸檢測方法的開發(fā)，試劑的驗證評價以及檢測實驗室的質(zhì)量控制。這9種試劑盒的信息見表7。

4 結(jié) 論

針對新型冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的現(xiàn)狀，研制了高低2種水平的新冠病毒基因組RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有新冠病毒完整的核酸序列，對不同核酸檢測試劑盒具有普遍的適用性。利用研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對9種SARS-CoV-2熒光定量PCR檢測試劑盒的性能進(jìn)行評價，證實了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的適用性良好。同時研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為新型冠狀病毒核酸檢測方法的開發(fā)、實驗室質(zhì)量控制以及測量結(jié)果的量值溯源等提供了重要的標(biāo)準(zhǔn)和計量技術(shù)支撐，為新型冠狀病毒的檢測奠定了一定的技術(shù)基礎(chǔ)。

表7 qRT-PCR試劑盒信息Tab.7 qRT-PCR kit information