孫繼鑫，徐志偉，代重陽，孟 飛，王 聰

（1.內(nèi)蒙古民族大學 農(nóng)學院，內(nèi)蒙古 通遼028043；2.呼和浩特市賽罕區(qū)蔬菜局，內(nèi)蒙古 呼和浩特010000）

豆科植物和根瘤菌共生固氮所產(chǎn)生的生物固氮體系是自然界中最重要體系之一［1］，根瘤的共生固氮對豆科植物產(chǎn)量的提高和品質(zhì)的提升起重要作用.同時，對減少氮肥用量、維持農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展以及提高作物品質(zhì)也具有重要意義［2］.豆科植物和根瘤菌之間所產(chǎn)生的共生固氮作用會受到環(huán)境因子的限制，特別是逆境脅迫會對豆科植物根瘤的形成、發(fā)育以及根瘤的固氮效率產(chǎn)生影響，并對豆科植物和根瘤菌建立共生體系有重大影響［3］.李梅等［4］發(fā)現(xiàn)，當鹽濃度升高至100 mmol·L-1時，根瘤數(shù)量和固氮區(qū)細胞數(shù)量會隨著濃度的升高不斷減少，且根瘤不斷變小.Abdel等［5］表明，較低濃度的鹽脅迫環(huán)境會對固氮酶活性和豆血紅蛋白含量產(chǎn)生較多影響，而鹽脅迫濃度較高的環(huán)境會對根瘤菌的質(zhì)量和數(shù)量產(chǎn)生更大的影響，同時，豆科植物和根瘤菌良好的共生關(guān)系也會使植物的耐鹽性得到提高.

菜用大豆是蔬菜食用大豆的總稱，隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，近年來我國菜用大豆的栽培面積逐年增加，但中國的鹽堿土總面積超過900 0萬hm2，且受全球氣候變暖、工業(yè)污染加劇和化肥施用不當?shù)纫蛩赜绊?，土壤鹽漬化不斷加重，導致豆科植物的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)受到嚴重威脅［6-9］.因此，如何緩解鹽脅迫傷害，在逆境下維持豆科植物較強的結(jié)瘤固氮能力，已成為當前迫切需要解決的問題.本研究以耐鹽品種和鹽敏感品種的菜用大豆與根瘤菌共生體為試材，研究NaCl脅迫對菜用大豆結(jié)瘤固氮的影響，以期為豆科植物抗鹽機理的深入研究奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗材料 菜用大豆品種為鹽敏感品種“日本青”和耐鹽品種“綠領(lǐng)八號”（耐鹽性為前期試驗篩選）.“日本青”接種與其共生匹配性較好的快生型根瘤菌HH103，“綠領(lǐng)八號”接種與其共生匹配性較好的慢生根瘤菌USDA122，均購自黑龍江省農(nóng)科院微生物研究所［10］.

1.2 試驗方法

1.2.1 試材培育 挑選種皮較飽滿的種子用95%乙醇沖洗，播種于口徑10 cm、高10 cm的塑料缽中，采用蛭石作為基質(zhì)，在每缽中播種2粒，定植1株，于人工氣候箱中進行培育.

1.2.2 試驗處理 試驗設(shè)0（CK），50，75，100，125 mmol·L-15個NaCl濃度處理.待幼苗2片真葉完全展開后，在1/4 濃度無氮營養(yǎng)液中加入不同濃度的NaCl，在基質(zhì)中均勻澆入；使用無菌水配置的水溶液施用于上述各處理，每處理10株，3次重復(fù)，完全隨機排列.

1.2.3 菌懸液制備 通過活化、純化后將根瘤菌接種到液體培養(yǎng)基中，在29 ℃、180 r·min-1振蕩條件下黑暗培養(yǎng)，慢生菌種培養(yǎng)72 h，快生菌種培養(yǎng)48 h.

1.2.4 接種 NaCl處理后隨即在幼苗的2片真葉完全展開后進行接種.將稀釋后的根瘤菌懸浮液在幼苗根部周圍用移液槍給每株接種1 mL.

1.3 指標測定 根瘤固氮酶活性的測定見參考文獻［11］；豆血紅蛋白含量的測定見參考文獻［12］；根瘤類菌體NH3含量、根瘤細胞漿NH3含量見參考文獻［13］；根系活力的測定見參考文獻［14］.

1.4 數(shù)據(jù)分析 方差分析等使用Excel與SPSS軟件進行分析并處理數(shù)據(jù).

2 結(jié)果與分析

2.1 對生物量的影響 由表1可知，在不同濃度NaCl處理下，2個菜用大豆品種的地上部及地下部生物量均較對照顯著降低，且降幅隨NaCl 濃度的增大而增加，日本青地上部、地下部生物量在50，75，100，125 mmol·L-1NaCl濃度下的降幅分別為16%，28%，36%，41%和28%，49%，51%，59%；綠領(lǐng)八號地上部、地下部生物量的降幅分別為13%，18%，37%，40%和22%，33%，47%，53%.除了在100 mmol·L-1NaCl濃度下綠領(lǐng)八號的地上部降幅高于日本青外，其余不同脅迫濃度下的降幅均低于日本青，同時，2個品種地下部生物量在不同濃度下的降幅均高于地上部.表明NaCl脅迫下2個品種地上部和地下部的生長均受到顯著抑制，且受抑制程度隨著脅迫濃度的增加呈逐漸增強趨勢，而鹽脅迫的危害對于根系更加嚴重.與日本青相比，NaCl脅迫對綠領(lǐng)八號根系及地上部生長的危害均相對較輕.

Tab. 1 Effects of NaCl stress on biomass of vegetable soybean表1 NaCl脅迫對菜用大豆生物量的影響

2.2 對根瘤形成、生長及固氮量的影響 由表2可知，在不同濃度NaCl處理下，日本青的根瘤數(shù)、根瘤鮮重、地上部植株含氮量、地下部植株含氮量均較對照顯著降低，除了根瘤鮮重在125 mmol·L-1時和地下部植株含氮量在100 mmol·L-1時降低幅度隨NaCl濃度的增大而減小外，其余濃度下降幅度均隨NaCl濃度的增大而增加.在50，75，100，125 mmol·L-1NaCl 處理下，根瘤數(shù)、根瘤鮮重較對照的降幅分別為21%，33%，46%，51%和21%，29%，41%，38%；地上部、地下部植株含氮量較對照的降幅分別為8%，10%，18%，21%和19%，30%，28%，35%.綠領(lǐng)八號在不同脅迫濃度下根瘤數(shù)、根瘤鮮重較對照的降幅分別為16%，30%，41%，47%和15%，25%，33%，35%；地上部、地下部植株含氮量較對照的降幅分別為7%，12%，17%，20%和14%，24%，21%，32%.綠領(lǐng)八號的根瘤數(shù)、根瘤鮮重及根系含氮量的降幅均低于日本青.表明NaCl脅迫下對2個品種根瘤形成、生長及固氮均產(chǎn)生了顯著的抑制作用，且受抑制程度隨著脅迫濃度的增大呈逐漸增強趨勢.與日本青相比，綠領(lǐng)八號在NaCl脅迫下保持了相對較強的結(jié)瘤、固氮能力.

表2 NaCl脅迫對菜用大豆根瘤形成、生長及固氮量的影響Tab. 2 Effects of NaCl stress on root nodule formation，growth and amount of nitrogen fixation of vegetable soybean

2.3 對大豆根系活力的影響 由圖1可知，在不同濃度NaCl處理下，2個品種的根系活力均較對照顯著降低，且降幅隨NaCl濃度的增大而增加，日本青根系活力在50，75，100，125 mmol·L-1NaCl濃度下的降幅分別為17%，29%，66%，71%；綠領(lǐng)八號根系活力的降幅分別為17%，27%，54%，61%.除了在50 mmol·L-1NaCl濃度下綠領(lǐng)八號降幅與日本青相同外，其余不同脅迫濃度下的降幅均低于日本青.表明NaCl脅迫下2個品種的根系活力均受到顯著抑制，且受抑制程度隨著脅迫濃度的增加呈逐漸增強趨勢，與日本青相比，綠領(lǐng)八號的根系活力在不同濃度NaCl脅迫下均保持相對較高活力.

2.4 對大豆根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶活性的影響 由表3可知，在不同濃度NaCl處理下，日本青的根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶活性均較對照顯著降低，除了根瘤豆血紅蛋白含量在125 mmol·L-1時降低幅度隨NaCl濃度的增大而減小外，其余濃度下降幅均隨NaCl濃度的增大而增加.在50，75，100，125 mmol·L-1NaCl處理下，根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶活性較對照降幅分別為9%，19%，33%，28%和13%，26%，33%，34%.綠領(lǐng)八號在不同脅迫濃度下根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶活性均較對照降幅分別為7%，15%，26%，26%和9%，23%，30%，30%.綠領(lǐng)八號的根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶活性的降幅均低于日本青.表明NaCl脅迫下對2個品種固氮酶活性的提高以及根瘤豆血紅蛋白的合成均產(chǎn)生了顯著的抑制作用，且受抑制程度隨著脅迫濃度的增大不斷增強，但當濃度達到125 mmol·L-1時受抑制程度隨著脅迫濃度的增大開始減弱.與日本青相比，綠領(lǐng)八號維持了相對較高的根瘤豆血紅蛋白含量和較強的固氮酶活性.

2.5 對根瘤類菌體中氨含量和根瘤細胞漿中氨含量的影響 由表4可知，在不同濃度NaCl處理下，日本青根瘤類菌體中氨含量較對照顯著降低，且降幅隨NaCl濃度的增大而增加，在50，75，100，125 mmol·L-1NaCl處理下，其降幅分別為8%，13%，23%，27%；綠領(lǐng)八號在50 mmol·L-1NaCl濃度下的根瘤類菌體中氨含量未受顯著影響，然而隨著脅迫濃度升高，氨的形成受到顯著抑制，氨含量在75，100，125 mmol·L-1NaCl降幅分別達11%，20%，21%.2個品種根瘤細胞漿中氨含量在50 mmol·L-1NaCl下均未受顯著影響，其余濃度下均顯著升高，日本青較對照的增幅分別為27%，28%，45%.綠領(lǐng)八號的增幅分別為22%，32%，40%.可見NaCl 脅迫對2 個品種根瘤中N2的還原及NH3的進一步轉(zhuǎn)化均產(chǎn)生了顯著的抑制作用，但較低濃度的NaCl對NH3轉(zhuǎn)化的影響不顯著.綠領(lǐng)八號與日本青相比，在NaCl脅迫下顯示出較強的N2固定及轉(zhuǎn)化能力.

圖1 NaCl脅迫對菜用大豆根系活力的影響Fig. 1 Effects of NaCl stress on root activity of vegetable soybean

表3 NaCl脅迫對菜用大豆根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶的影響Tab. 3 The effects of NaCl stress on the hemoglobin content and nitrogenase activity of vegetable soybean root nodule leghemoglobin

表4 NaCl脅迫對菜用大豆根瘤類菌體和細胞漿中氨含量的影響Tab. 4 Effects of NaCl stress on ammonia content in root nodule bacteria and cytoplasm of vegetable soybean

3 討論與結(jié)論

鹽脅迫會使豆科植物根瘤的形成、發(fā)育及根瘤的固氮效率受到影響.王登科等［15］研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫對根瘤菌的生長起到抑制作用，最終使豆科植物的早期生長由于根瘤菌的抗氧化能力降低而受到限制.較低濃度的NaCl影響的是豆血紅蛋白含量和根瘤固氮酶活性，而高濃度的NaCl會使大豆結(jié)瘤數(shù)和根瘤質(zhì)量降低從而降低根瘤的固氮效率［16］.本研究中，2 個菜用大豆品種根瘤數(shù)、根瘤鮮重、固氮量在不同濃度NaCl脅迫下均顯著下降，且受抑制程度隨著鹽脅迫濃度的增加而呈逐漸增強趨勢，這與陳慧等［17］的研究結(jié)果不同.

根系活力是客觀反映植物生理活性的重要指標，根系活力的強弱直接影響植物對土壤中礦物質(zhì)元素和水分的吸收能力.NaCl 脅迫下菜用大豆根系發(fā)育受阻［18］，根系活力減弱，進而導致地上部生長受阻.根毛在信號識別、根瘤菌侵染過程中發(fā)揮著重要作用，而來自地上部的光合產(chǎn)物是根瘤生長發(fā)育的重要碳源和能源，因此，菜用大豆根瘤少而小的重要原因之一可能是因根系發(fā)育不良、根系活力減弱導致.

根瘤類菌體中的N2在固氮酶的作用下還原為NH3，并快速轉(zhuǎn)移到細胞漿中，NH3通過谷氨酸合成酶（GOGAT）和谷氨酰胺合成酶（GS）作用轉(zhuǎn)化為氨基酸，當NH3迅速轉(zhuǎn)化為氨基酸并且合成蛋白質(zhì)時，固氮作用才能不斷進行［19］.此外，豆血紅蛋白對根瘤固氮酶活性需要低氧和高流量條件下才能發(fā)揮作用.豆血紅蛋白可以維持豆科植物根瘤內(nèi)較低O2，并可以給類菌體內(nèi)的含鐵血紅蛋白有效地傳遞O2，且根瘤固氮酶活性也隨其濃度的增大而增加［20-21］.本研究中，不同濃度NaCl脅迫下2個菜用大豆品種根瘤豆血紅蛋白含量均顯著降低，由于固氮酶活性的發(fā)揮對低氧高流量環(huán)境的需求隨著根瘤豆血紅蛋白含量的降低而無法保證，進而導致固氮酶活性受到抑制.不同濃度NaCl處理后，2個菜用大豆品種根瘤類菌體中氨含量顯著降低，這與根瘤固氮酶活性降低是由根瘤豆血紅蛋白含量降低所導致有關(guān).同時，NaCl脅迫下根瘤細胞漿中NH3濃度顯著增高，表明NaCl 處理造成NH3進一步轉(zhuǎn)化障礙，而根瘤固氮酶活性也因細胞漿中NH3含量的積累產(chǎn)生反饋抑制.

本研究中，不同濃度NaCl處理下，耐鹽品種“綠領(lǐng)八號”的結(jié)瘤數(shù)、瘤重及根部固氮量的降幅均低于鹽敏感品種“日本青”，這與綠領(lǐng)八號在NaCl脅迫下能維持相對較高的豆血紅蛋白含量、固氮酶活性，較強的根系活力以及較強的NH3轉(zhuǎn)化能力密切相關(guān).值得注意的是，NaCl脅迫下2品種菜用大豆地上部含氮量的降幅相近且均大幅低于地下部，表明NaCl脅迫下，菜用大豆將固定轉(zhuǎn)化的氮素優(yōu)先供給地上部，且2個品種氮素向地上部的轉(zhuǎn)運能力相近.

根系活力、根瘤豆血紅蛋白含量、固氮酶活性及NH3的進一步轉(zhuǎn)化能力顯著下降，是NaCl脅迫導致2個菜用大豆品種根瘤形成及發(fā)育受阻、固氮效率下降的重要因素.NaCl脅迫下，耐鹽品種“綠領(lǐng)八號”具有相對較強的結(jié)瘤固氮能力，這與其能夠維持相對較強的根系活力、根瘤豆血紅蛋白含量、固氮酶活性及NH3的進一步轉(zhuǎn)化能力密切相關(guān).