李 輝 李德芳 鄧 勇 潘 根 陳安國 趙立寧 唐慧娟

專題

紅麻非生物逆境脅迫響應(yīng)基因表達分析及轉(zhuǎn)化擬南芥

李 輝1,2李德芳2,*鄧 勇2潘 根2陳安國2趙立寧2唐慧娟2

1湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 湖南常德 415000;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所, 湖南長沙 410205

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)非生物逆境脅迫過程中具有重要的調(diào)控作用。本研究根據(jù)紅麻轉(zhuǎn)錄組unigene序列(CL3883.Contig4), 設(shè)計引物進行PCR擴增, 經(jīng)sanger測序獲得全長為957 bp的基因cDNA序列。該基因開放讀碼框為957 bp, 編碼1個含有318個氨基酸的蛋白, 具有1個WRKY功能保守結(jié)構(gòu)域, 屬于II類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。在鹽脅迫下,基因表達量隨NaCl溶液濃度升高而增加; 在干旱脅迫下,基因表達量隨干旱脅迫時間的增加呈現(xiàn)先下降再上升然后再下降的趨勢; 在重金屬鎘脅迫下,基因表達量隨CdCl2溶液濃度的增加而降低。表明該基因表達受鹽、干旱和重金屬鎘脅迫的誘導(dǎo)。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)花序浸染法將該基因轉(zhuǎn)化擬南芥發(fā)現(xiàn),基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的耐鹽性, 這為進一步研究基因的耐逆機制奠定了堅實的基礎(chǔ)。

紅麻; 耐鹽; 干旱; 重金屬鎘;

紅麻(L.)是一年速生草本纖維作物。隨著人們環(huán)保意識的增強, 全球?qū)τ谔烊焕w維的需求日益增加, 大力發(fā)展紅麻產(chǎn)業(yè)是滿足天然纖維需求的重要途徑之一[1]。然而隨著全球人口的增加, 人口、糧食、耕地之間的矛盾日益加劇, 紅麻的種植必須轉(zhuǎn)向鹽堿地、干旱坡地、不能生產(chǎn)糧食的重金屬污染土地。因此, 研究紅麻的耐逆機制, 選育紅麻耐逆品種對維持紅麻產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

高等植物在進化過程中形成了精細的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來應(yīng)對不同的逆境脅迫。轉(zhuǎn)錄因子如MYB[2]、WRKY[3]、NAC[4]在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮極其重要的作用, 它們通過激活/抑制下游基因表達來提高植物本身對逆境的適應(yīng)能力。其中WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物體內(nèi)特有的轉(zhuǎn)錄因子家族, 其特點是DNA結(jié)合域的N-端至少包含一段保守的WRKYGQK序列, C-端是一個類鋅指結(jié)構(gòu)域。DNA結(jié)合域通過與啟動子中的W-box序列結(jié)合來調(diào)節(jié)靶標基因的表達[5]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在植物響應(yīng)干旱、鹽、重金屬、溫度、病害等多種非生物/生物脅迫過程中具有重要的調(diào)控功能, 且不斷有新的家族成員被鑒定[6]。Wu等[7]在菜豆基因組中發(fā)現(xiàn)了19個WRKY響應(yīng)基因, 在干旱脅迫條件下, 其中11個表現(xiàn)為下調(diào)表達, 8個表現(xiàn)為上調(diào)表達。王巖巖等[8]研究表明, 野生大豆基因表達受干旱脅迫的誘導(dǎo), 且隨干旱脅迫時間的增加,基因表達呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢?？碌は嫉萚9]研究表明, 大豆基因表達受鹽脅迫誘導(dǎo), 并且能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因百脈根的耐鹽性。甘蔗基因在NaCl脅迫下顯著上調(diào)表達, 推測該基因在甘蔗響應(yīng)NaCl脅迫過程中具有一定的調(diào)控作用[10]。在低溫脅迫條件下, 轉(zhuǎn)基因的擬南芥與野生型相比, 具有較高的存活率。在低溫脅迫和外源ABA誘導(dǎo)下,基因出現(xiàn)上調(diào)表達[11]。王影等[12]研究表明, 東南景天基因表達受鎘脅迫的誘導(dǎo), 且隨鎘脅迫時間的增加, 其表達量逐漸降低, 推測其在鎘脅迫響應(yīng)早期具有重要作用。以上研究證實, WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抵御各種非生物脅迫過程中具有正向或負向的調(diào)控功能。但目前關(guān)于WRKY基因家族成員在紅麻非生物逆境脅迫響應(yīng)過程中的作用鮮見報道。

本課題組前期通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得unigene序列(CL3883.Contig4)[13], 通過NCBI的在線工具Blast分析發(fā)現(xiàn), 其編碼產(chǎn)物為轉(zhuǎn)錄因子WRKY71, 且該unigene受鹽脅迫的誘導(dǎo)。因此, 本研究克隆了基因序列, 利用實時熒光定量PCR的方法分析了其在鹽、干旱和重金屬不同逆境脅迫下的時空表達特征, 并轉(zhuǎn)化擬南芥進行初步功能驗證, 旨在為進一步研究該基因耐鹽的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅麻16號由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所提供。挑選籽粒飽滿、大小均勻的紅麻種子, 用0.1%的氯化汞消毒10 min, 蒸餾水沖洗3次, 然后播種于發(fā)芽盒中, 置光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d后, 選取植株健壯、長勢均勻的紅麻幼苗, 移植到1/2 Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)。紅麻幼苗植株長到四葉一心時, 選取20株幼苗進行NaCl脅迫處理, 每個處理5株, 1/2 Hoagland營養(yǎng)液中NaCl的最終濃度分別為0、50、100、200 mmol L-1; 同樣選取20株幼苗進行干旱處理, 將選取的幼苗根部暴露在空氣中, 不進行供水處理, 處理時間為0、0.5、1.0、2.0、4.0 h, 每個處理5株; 同樣選取20株幼苗進行重金屬鎘脅迫處理, 每個處理5株, 1/2 Hoagland營養(yǎng)液中氯化鎘(CdCl2)的最終濃度分別為0、50、100、150 μmol L-1。分別取每個處理組紅麻植株的根、莖、葉, 液氮速凍, 放置于-80℃冰箱備用。

1.2 紅麻HcWRKY71基因的克隆及測序

利用植物總RNA提取試劑盒(DP432) (天根生化科技北京有限公司)提取200 mmol L-1NaCl處理的紅麻植株葉片總RNA, 然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 進行PCR擴增。根據(jù)課題組轉(zhuǎn)錄組unigene序列(編號: CL3883.Contig4), 利用PrimerPremier 5.0設(shè)計基因全長擴增引物HcWRKY71-F/R (表1)。PCR反應(yīng)的體系包括2.5 μL 10× PCR buffer (Mg2+plus)、0.25 μL酶 (TaKaRa, 中國大連)、1 μL 2.5 mmol L-1dNTP、0.25 μL 10 μmol L-1HcWRKY71-F、0.25 μL 10 μmol L-1HcWRKY71-R、20 ng cDNA, ddH2O補足25 μL。PCR擴增的反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性2 min; 94℃變性30 s, 55℃退火30 s,72℃延伸60 s, 30個循環(huán); 72℃延伸3 min, 4℃終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。參照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技北京有限公司)的說明書切膠回收, 然后將回收片段連接到pMD19-T載體上, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞, 挑取陽性菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 本研究所用引物

1.3 紅麻HcWRKY71基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI在線程序ORF finder (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和NCBI Conservered Domain (https//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)預(yù)測基因序列的最大開放讀碼框及其保守功能結(jié)構(gòu)域; 運用在線工具(http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)和NetPhos2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分別預(yù)測基因編碼蛋白質(zhì)的分子量和等電點及其蛋白磷酸化位點; 利用在線工具BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對HcWRKY71的氨基酸序列進行在線序列比對; 利用DNAMAN軟件進行基因氨基酸序列一致性比對; 利用MEGA6.0軟件構(gòu)建基因系統(tǒng)進化樹。

1.4 紅麻HcWRKY71基因在鹽、干旱、重金屬鎘脅迫下的表達分析

紅麻幼苗植株分別在NaCl和CdCl2脅迫下生長2周后, 剪取每個處理的紅麻植株葉片, 進行濃度梯度的表達分析, 同時剪取紅麻植株的根、莖、葉進行組織特異性表達分析。干旱脅迫條件下, 分別剪取不同處理時間的紅麻植株葉片, 進行不同脅迫時間的表達分析; 紅麻干旱處理8 h時, 剪取紅麻植株的根、莖、葉, 進行組織特異性表達分析。每個處理取樣后, 分別提取總RNA, 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 利用熒光定量PCR檢測基因表達量。熒光定量PCR引物為HcWRKY71-QF/QR (表1), 內(nèi)參基因為, 內(nèi)參引物為Actin-QF/QR (表1)。熒光定量PCR反應(yīng)體系10 μL, 包括Power 2×SYBR PCR Premixture 5 μL、上下游引物各0.3 μL、cDNA 2 μL, ddH2O補足10 μL。熒光定量PCR反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性2 min, 95℃變性15 s, 61℃退火15 s, 72℃延伸20 s, 40個循環(huán)。每個反應(yīng)設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù), 每個生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)。

1.5 紅麻HcWRKY71基因通過花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥

設(shè)計含有H I和I 2個限制性內(nèi)切酶位點的表達引物PC1301-35S--GFP-F/R (表1), 以陽性克隆載體pMD19-T為模板進行PCR擴增, 并回收PCR擴增產(chǎn)物。利用限制性內(nèi)切酶H I,I分別對表達載體pC1301-35S-GFP和PCR產(chǎn)物進行雙酶切, 利用T4DNA聚合酶將目的基因片段和載體連接。將連接好的重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中, LB培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h, 涂含有卡那霉素的平板, 37℃倒置培養(yǎng)18 h, 經(jīng)菌落PCR測序驗證獲得重組表達質(zhì)粒pC1301-35S-- GFP。將重組質(zhì)粒通過電擊法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中, 用含有卡那霉素(50 mg L-1)和利福平(50 mg L-1)雙抗的LB固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)、篩選, 獲得含有功能質(zhì)粒的農(nóng)桿菌。挑取單菌落接種到含有卡那霉素(50 mg L-1)和利福平(50 mg L-1)的LB液體培養(yǎng)基, 培養(yǎng)至OD600為1.2。離心收集菌液, 然后加入50 mL懸浮液(1/2 MS培養(yǎng)基, 50 g L-1蔗糖, 0.5 g L-12-嗎啉乙磺酸, 用NaOH (1 mol L-1)溶液調(diào)pH 5.7, 加表面活性劑Silwet至終濃度為0.02%)懸浮菌液。將培養(yǎng)4周左右剛開花的擬南芥植株上的果莢去掉, 將整個花序浸入懸浮好的菌液10 s, 暗培養(yǎng)24 h, 正常培養(yǎng)1周后再浸染1次。果莢變黃后收獲T0代轉(zhuǎn)基因種子。

1.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥純合株系的篩選及幼苗耐鹽性鑒定

用次氯酸鈉消毒T0代轉(zhuǎn)基因種子6~7 min, 然后用蒸餾水洗滌3~5次。用移液槍將消毒后的種子點種在含有40 mg L-1潮霉素的MS培養(yǎng)基上, 對轉(zhuǎn)基因種子進行抗性篩選。將健壯綠色的轉(zhuǎn)基因幼苗移栽到滅菌的營養(yǎng)土培養(yǎng), 然后單株收獲T1代種子。根據(jù)孟德爾遺傳定律T1代轉(zhuǎn)基因種子含有雜合種子需要進一步進行篩選, 篩選方法同上, 然后單株收獲T2代種子。T2代種子繼續(xù)篩選, 如果T2代單株收獲的種子沒有發(fā)生分離, 則該單株為純合植株, 此時篩選單株收獲的種子為T3代, 則該單株收獲的T3代種子為純合株系。

將篩選獲得純合的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子和野生型擬南芥種子消毒后分別播種于MS培養(yǎng)基上, 待擬南芥幼苗長到四葉一心時移栽到裝有滅菌營養(yǎng)土(營養(yǎng)土與蛭石按3︰1的比例混合)的塑料花盆。光照培養(yǎng)室培養(yǎng)5 d后用100 mmol L-1NaCl溶液脅迫處理, 對轉(zhuǎn)基因幼苗耐鹽性進行鑒定。

1.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥目的基因PCR鑒定及熒光定量分析

將篩選獲得純合的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子和野生型擬南芥種子消毒后分別播種于MS培養(yǎng)基上, 待擬南芥幼苗長到四葉一心時移栽到裝有滅菌營養(yǎng)土(營養(yǎng)土與蛭石按3︰1的比例混合)的塑料花盆。光照培養(yǎng)室培養(yǎng)7 d后用100 mmol L-1NaCl溶液脅迫處理, 24 h后分別提取對照條件下野生型擬南芥植株和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的總RNA以及鹽脅迫下野生型擬南芥植株和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的總RNA, 進行目的基因檢測和熒光定量分析。用于目的基因PCR檢測和熒光定量分析的引物HcWRKY71-PF/R (表1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅麻HcWRKY71基因的克隆和測序

根據(jù)紅麻轉(zhuǎn)錄組unigene序列(編號: CL3883.Contig4), 設(shè)計特異性引物, 進行PCR擴增, 獲得長度為957 bp的cDNA序列, 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 結(jié)果如圖1所示。對PCR產(chǎn)物進行切膠回收, 然后連接到pMD19-T載體上, 送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

M: 2K Plus II; 1: PCR產(chǎn)物。

M: DNA marker 2K Plus II; 1: PCR product.

2.2 紅麻HcWRKY71基因的生物信息學(xué)分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)sanger測序, 獲得長度為957 bp cDNA序列, 經(jīng)NCBI ORF Finder在線預(yù)測,基因的開放讀碼框為957 bp, 編碼1個含有318個氨基酸的蛋白(圖2)。NCBI在線預(yù)測該蛋白的保守功能域發(fā)現(xiàn), 該蛋白含有1個WRKY功能保守結(jié)構(gòu)域(172~229位) (附圖1), 屬于第二類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。利用在線工具預(yù)測該蛋白的理論分子量為35.5 kD, 等電點為7.24。蛋白質(zhì)磷酸化位點預(yù)測結(jié)果(附圖2)顯示, 該蛋白質(zhì)含有32個絲氨酸、7個酪氨酸、18個蘇氨酸, 其中位于第189位、194位、212位的絲氨酸和位于第199位、200位、204位、218位和221位的蘇氨酸位的磷酸化位點, 位于WRKY的保守功能域內(nèi), 推測這8個磷酸化位點可能對HcWRKY71轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控具有重要作用。

HcWRKY71轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列相似性通過NCBI BlastP比對發(fā)現(xiàn), 紅麻與雷蒙德氏棉(XP_012445471.1)、可可(XP_017978107.1)、榴蓮(XP_022720946.1)、哥倫比亞錦葵(XP_021293950.1)、葡萄(XP_002272089.1)、棗(XP_015876832.1)、梨(XP_009353824.1)、蘋果(XP_008383508.1)、橄欖(XP_022879638.1)的氨基酸序列相似性分別為84%、80%、79%、79%、60%、60%、57%、57%、53%。DNAMAN的分析結(jié)果(圖3)表明, 上述物種氨基酸序列的一致性為67.92%。WRKY的功能結(jié)構(gòu)域高度保守, 其他位置氨基酸序列, 由于物種的不同表現(xiàn)出不同的變化。WRKY71轉(zhuǎn)錄因子可能在不同的物種中具有相似的生物學(xué)功能。

利用MEGA6.0軟件分析HcWRKY71轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列與具有代表性的雷蒙德氏棉(XP_012445471.1)、可可(XP_017978107.1)、榴蓮(XP_022720946.1)、哥倫比亞錦葵(XP_ 021293950.1)、葡萄(XP_002272089.1)、棗(XP_ 015876832.1)、梨(XP_009353824.1)、蘋果(XP_ 008383508.1)、橄欖(XP_022879638.1)氨基酸序列的進化關(guān)系(圖4)發(fā)現(xiàn), 紅麻與雷蒙德氏棉的關(guān)系最近, 這可能是兩者同屬于錦葵科的緣故。而紅麻與橄欖的關(guān)系最遠。

紅色框為WRKYGQK基序; 黑色框為C2H2基序(CX4CX23HXH)。

The sequence of WRKYGQK motif is highlighted in red box, that of C2H2motif (CX4CX23HXH) in black box.

2.3 鹽脅迫下紅麻HcWRKY71基因的表達分析

分別提取0、50、100、200 mmol L-1NaCl脅迫下紅麻葉片總RNA, 并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為熒光定量PCR反應(yīng)的模板, 進行定量分析。基因表達量隨NaCl濃度的增加而增加。當NaCl濃度為100 mmol L-1和200 mmol L-1時基因表達量與對照表達量相比, 達到極顯著差異水平(< 0.01) (圖5-A)。

分別提取對照和200 mmol L-1NaCl脅迫下紅麻根、莖、葉的總RNA, 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA進行熒光定量PCR分析?；蛟诟?、莖、葉中均有表達, 其表達量沒有顯著差異。在NaCl脅迫下, 根、莖、葉中基因表達量均有增加, 其中根部的表達量上升最多, 與對照表達量相比, 具有極顯著差異(< 0.01) (圖6-A)?？梢娀虻谋磉_是受NaCl脅迫誘導(dǎo)。

2.4 干旱脅迫下紅麻HcWRKY71基因的表達分析

分別提取0、0.5、1.0、2.0、4.0 h干旱脅迫下紅麻葉片總RNA, 并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為熒光定量PCR反應(yīng)的模板, 進行定量分析?；虮磉_量隨干旱脅迫時間的增加先下降再上升然后再下降。干旱脅迫0.5 h時,基因的表達量下調(diào), 其表達量與對照的表達量相比, 達到顯著差異水平(< 0.05); 干旱脅迫2 h時,基因的表達量達到最高, 其表達量與對照的表達量相比, 達到極顯著差異水平(< 0.01) (圖5-B)。

不同顏色代表不同氨基酸殘基的保守性。藍色表示氨基酸完全保守; 粉紅色、青色、黃色分別表示氨基酸的保守性為75%以上、50%以上及33%以上; 白色表示氨基酸的保守性不足33%。

The different color indicates that the different levels of the conservation amino acid residues. The blue means amino acids are complete conservation, the pink, cyan, yellow means that the conservation of amino acids is no less than 75%, no less than 50%, no less than 33% and white means no more than 33%.

分別提取對照和干旱脅迫8 h時紅麻植株根、莖、葉的總RNA, 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA進行熒光定量PCR分析。基因在根、莖、葉中均有表達, 其表達量沒有顯著差異。在干旱脅迫條件下, 根、莖、葉中基因表達量均有增加, 且根中表達量增加最多, 與對照相比差異不顯著(圖6-B)。這可能是干旱脅迫后期基因表達量出現(xiàn)下降的原因。綜上所述,基因的表達受干旱脅迫誘導(dǎo)。

2.5 CdCl2脅迫下紅麻HcWRKY71基因的表達分析

分別提取0、50、100、150 μmol L-1CdCl2脅迫下紅麻葉片總RNA, 并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為熒光定量PCR反應(yīng)的模板, 進行定量分析。基因的表達量隨著CdCl2濃度的增加而減少, 其表達量與對照的表達量相比, 達到極顯著差異水平(< 0.01) (圖5-C)。

分別提取對照和CdCl2(100 μmol L-1)脅迫下紅麻根、莖、葉的總RNA, 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA進行熒光定量PCR分析?；蛟诟?、莖、葉中均有表達, 其表達量沒有顯著差異; 在CdCl2脅迫條件下, 根、莖、葉中基因表達量均有下降, 與對照相比根和葉中的表達量下降達顯著水平, 其中根部的表達量下降最多(圖6-C)。由此可見,基因的表達受CdCl2脅迫誘導(dǎo)。

A: 鹽脅迫; B: 干旱脅迫; C: 鎘脅迫。*和*分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著。誤差線為每組處理的標準誤差(= 3)。

A: salt stress; B: drought stress; C: cadmium stress. *, ** mean significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively. Error bars represent the standard error of each treating group (= 3).

A: 鹽脅迫; B: 干旱脅迫; C: 鎘脅迫。*和*分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著。誤差線為每組處理的標準誤差(= 3)。

A: salt stress; B: drought stress; C: cadmium stress. *, ** mean significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively. Error bars represent the standard error of each treating group (= 3).

2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥純合株系的獲得及幼苗耐鹽性鑒定

通過農(nóng)桿菌浸染花序法將紅麻基因轉(zhuǎn)化擬南芥, 收獲轉(zhuǎn)基因種子。利用含有40 mg L-1潮霉素的MS培養(yǎng)基對收獲的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子進行篩選, 結(jié)果如圖7-A所示。綠色健壯的幼苗為轉(zhuǎn)基因苗, 黃色弱小的幼苗為非轉(zhuǎn)基因苗。轉(zhuǎn)基因種子T0代、T1代、T2代經(jīng)過潮霉素篩選最終獲得純合的T3代轉(zhuǎn)基因株系。純合轉(zhuǎn)基因植株的獲得為進一步研究基因的功能奠定堅實的基礎(chǔ)。野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗在100 mmol L-1NaCl溶液脅迫下生長10 d后發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的耐鹽性顯著高于野生型擬南芥幼苗的耐鹽性。

2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥HcWRKY71基因的PCR鑒定和實時定量PCR分析

在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的泳道能夠觀察到明顯的條帶, 而在野生型擬南芥植株的泳道沒有看到明顯的電泳條帶(圖7-B)。這表明基因已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的基因組內(nèi)?；蛟趯φ找吧蛿M南芥植株和鹽脅迫下擬南芥植株中的表達量沒有顯著差異。基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的表達量顯著高于其在野生型擬南芥植株中的表達量(< 0.05), 在鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的表達量極顯著高于其在野生型擬南芥植株中的表達量(< 0.01) (圖7-C)。由此可見,基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中同樣受到鹽脅迫的誘導(dǎo), 在轉(zhuǎn)基因擬南芥響應(yīng)鹽脅迫的過程中同樣具有重要的作用。

A: 潮霉素鑒定; B: PCR鑒定; C: 實時定量PCR鑒定。*和*分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著。誤差線為每組處理的標準誤差(= 3)。

A: identification of transgenicby hygromycin; B: PCR identification of transgenicplant; C: real time quantitative PCR identification. *, ** mean significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively. Error bars represent the standard error of each treating group (= 3).

3 討論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是植物體內(nèi)最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一, 在多種植物中都發(fā)現(xiàn)了WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員。本課題組通過對轉(zhuǎn)錄組序列CL3883.Contig4進行序列分析發(fā)現(xiàn), CL3883.Contig4中間含有1個完整的閱讀框, 即包含具有完整的起始密碼子和終止密碼子序列。根據(jù)完整的閱讀框序列設(shè)計引物、擴增、測序獲得基因完整的cDNA序列。根據(jù)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),基因的編碼產(chǎn)物為紅麻HcWRKY71轉(zhuǎn)錄因子。

轉(zhuǎn)錄因子WRKY71在植物生長發(fā)育[14]、逆境脅迫[15]、防御[16]等方面具有重要的調(diào)控功能。目前有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子WRKY71的調(diào)控功能主要集中在植物的生長發(fā)育和生物逆境脅迫響應(yīng)方面。在擬南芥中, AtWRKY71通過調(diào)控基因提高腋芽分生組織的活性, 從而增加擬南芥的分枝數(shù); 通過直接激活開花基因和加速擬南芥開花[17-19]。Qin等[20]研究表明, 在轉(zhuǎn)基因擬南芥中, 通過小麥基因的過表達調(diào)控擬南芥植株內(nèi)IAA-MeIAA的激素水平來調(diào)控擬南芥下部葉片的發(fā)育。鄒克琴等[21]研究表明, 水稻基因的表達受水稻稻曲菌的侵染誘導(dǎo), 表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢, 推測其可能在稻曲菌防御過程中發(fā)揮重要作用。

在植物響應(yīng)非生物脅迫過程中WRKY71轉(zhuǎn)錄因子同樣具有重要的調(diào)控作用。在擬南芥中,基因表達受鹽脅迫的誘導(dǎo), 其過程快速而短暫。在轉(zhuǎn)基因的擬南芥超表達株系中, AtWRKY71通過抑制基因和的表達促進擬南芥開花[22]。Guo和Qin[18]的研究表明,基因可能參與多種非生物脅迫的生理響應(yīng)過程。在水稻中, OsWRKY71通過調(diào)控下游基因和的表達來提高轉(zhuǎn)基因水稻植株的耐寒性[23]。本研究通過熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn), 在NaCl溶液脅迫下,基因的表達量隨著NaCl溶液濃度的提高而增加, 這與耐鹽轉(zhuǎn)錄組的測序結(jié)果[13]相一致; 在干旱脅迫下,基因的表達量隨著時間的延長呈現(xiàn)出先下降在上升然后在下降的規(guī)律; 在CdCl2溶液脅迫下,基因的表達量隨著CdCl2溶液濃度的增加而降低。在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中,基因的表達同樣受到鹽脅迫的誘導(dǎo), 其表達量與野生型擬南芥的表達量相比顯著上調(diào)。表明,基因同時參與紅麻對鹽脅迫、干旱脅迫和重金屬鎘脅迫的響應(yīng)過程, 且在不同的逆境脅迫下具有不同的表達方式, 推測該基因在紅麻非生物逆境脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有關(guān)鍵樞紐作用。

在NaCl溶液、干旱和CdCl2溶液不同逆境脅迫下,基因在根中的表達量變化最大(圖6), 推測該基因在逆境脅迫響應(yīng)過程中主要通過調(diào)控根部的基因表達來提高紅麻自身的抗逆性。

4 結(jié)論

從紅麻16號中成功克隆出1個基因。該基因編碼1個含有318個氨基酸的II類WRKY轉(zhuǎn)錄因子?；蚴且粋€組成型且受鹽、干旱和重金屬鎘脅迫誘導(dǎo)表達的基因。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法和潮霉素篩選最終獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥的純合植株。苗期耐鹽性鑒定發(fā)現(xiàn),基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的耐鹽性。這為進一步研究該基因耐鹽的調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。

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附圖1 紅麻HcWRKY71蛋白的保守功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測

Fig. S1 Conserved domain prediction of HcWRKY71 protein in kenaf

附圖2 HcWRKY71轉(zhuǎn)錄因子磷酸化位點的預(yù)測

Fig. S2 Prediction of phosphorylation sites of transcription factor HcWRKY71

Expression analysis of abiotic stress response genein kenaf and transformation of

LI Hui1,2, LI De-Fang2,*, DENG Yong2, PAN Gen, CHEN An-Guo2, ZHAO Li-Ning2, and TANG Hui-Juan2

1College of Life and Environment Science, Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, Hunan, China;2Institute of Bast Fiber Crops, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410205, Hunan, China

WRKY transcription factor plays an important role in plant responded to abiotic stress. In this study, the unigene sequence (CL3883.Contig4) of the transcriptome in kenaf was used as a reference. Primers were designed for PCR amplification. The full length ofgene was 957 bp obtained by the sanger sequencing.gene had an open reading frame length of 957 bp, and encoded a protein containing 318 amino acids, with a conserved functional domain of WRKY, which belonged to WRKY transcription factor II. Under the salt stress, its relative expression level increased with the increase of NaCl concentration; under the drought stress, with the extension of drought time, the relative expression of thegene first decreased, then increased and finally decreased; under the stress of heavy metal cadmium, its expression decreased with the increase of CdCl2concentration, indicating that the expression of the gene was induced by salt, drought and heavy metal cadmium stress. The gene was transformed intoby-mediated inflorescence impregnation. It was found that thegene improved the salt tolerance of transgenicseedlings. This laid a solid foundation for further study of stress tolerance mechanism ofgene.

kenaf; salt tolerance; drought; heavy metal cadmium;

10.3724/SP.J.1006.2021.04201

本研究由國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-19-E07), 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程一年生麻類育種項目(ASTIP-IBFC03), 湖南省教育廳項目(18C0737)和湖南文理學(xué)院博士科研啟動項目(17BSQD13)資助。

This study was supported by the China Agriculture Research System (CARS-19-E07), the Agricultural Science and Technology Innovation Program at the Chinese Academy of Agricultural Science (ASTIP-IBFC03), the Hunan Education Department Project (18C0737), and the Doctoral Research Start-up Project of Hunan University of Arts and Sciences (17BSQD13).

李德芳, E-mail:18973612200@163.com

E-mail: guangjunmuzi@126.com

2019-12-19;

2020-10-14;

2020-09-08.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200905.1226.002.html