白玉潔 喻 晶 陳海丹 李冬青

(1. 武漢大學基礎醫(yī)學院 病原生物學系 微生物教研室， 湖北 武漢 430071； 2. 湖北省腫瘤醫(yī)院 檢驗科， 湖北 武漢 430065； 3. 三峽大學 第一臨床醫(yī)學院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 脊柱外科， 湖北 宜昌 443003)

肺癌是最兇險的腫瘤之一，5年生存率約為10%～20%[1,2]遠低于其他類型的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，2018年全球新增肺癌患者210萬例，死亡180萬人[3]。雖然目前已有成熟的腫瘤標志物，如癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)、糖類抗原(carbohydrate antigen 125，CA125)、鱗狀細胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCC)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronspecific enolase，NSE)、胃泌素前體釋放肽片段(pro-gastrin-releasing peptide，Pro-GRP)、細胞角蛋白 19 片段(CYFRA21-1)等用于腫瘤的篩查及治療效果評價，但肺癌臨床分型多，分子特征復雜，現(xiàn)有的肺癌腫瘤標志物對各型肺癌患者總生存率(overall survival，OS)的評價能力尚有不足。

Chromobox家族蛋白(CBX)是一類表觀遺傳調控復合物，它通過修飾染色質對目標基因進行轉錄抑制[4]。已知人類基因組中有8種CBX蛋白，都參與異染色質的調控、基因表達和發(fā)育程序。根據(jù)分子結構，CBX蛋白被分為兩類：HP1組(包括CBX1、CBX3和CBX5)和Pc組(包括CBX2、CBX4、CBX6、CBX7和CBX8)。CBX成員的表達水平與肺癌患者OS顯著相關，但不同家族成員之間并沒有一致性。因此，本研究擬通過生物信息學的手段，對已有的研究數(shù)據(jù)進行深入地發(fā)掘和歸納，以助于明確CBX蛋白對肺癌預后評估的意義。

1 材料和方法

1.1 利用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫分析CBX的mRNA表達水平

ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/resource/main.html)收錄了 715個數(shù)據(jù)集和86 733個樣本的芯片數(shù)據(jù)，用于DNA或RNA序列分析，功能十分強大[5]。本研究從該數(shù)據(jù)庫中獲得了8個CBX成員在不同腫瘤組織的轉錄表達數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)類型：mRNA)。用t檢驗比較腫瘤組織及其相鄰正常對照組之間轉錄表達的差異。以P值為0.01，差異倍數(shù)為1.5，基因排名前10%為閾值。

1.2 利用UALCAN分析肺腺癌組織中8個CBX家族成員的mRNA表達及其與臨床病理參數(shù)的關系

UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/)是一個用于分析腫瘤組學數(shù)據(jù)的web資源。它提供基于基因表達的潛在基因圖譜，以方便用戶獲取基因表達的信息[6]。本研究利用UALCAN分析了肺腺癌組織中8個CBX家族成員的mRNA表達及其與臨床病理參數(shù)的關系。t檢驗比較轉錄表達差異，P<0.01為顯著差異。

1.3 利用Human Protein Atlas分析人正常組織和肺腺癌組織中CBX的表達

Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/)包含了近20種常見腫瘤的免疫組化數(shù)據(jù)[7]。用戶可以獲取目標蛋白在特定腫瘤類型中的蛋白表達數(shù)據(jù)。本研究利用了該網(wǎng)站的免疫組化圖像數(shù)據(jù)，比較了不同CBX家族成員在人正常組織和肺腺癌組織中的表達情況。

1.4 利用 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析不同CBX基因mRNA表達對肺腺癌預后的價值

Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/analysis/)能夠評估54 000 個基因(mRNA、miRNA、蛋白質)對21種腫瘤生存率的影響，包括乳腺癌(6 234例)、卵巢癌(2 190例)、肺癌(3 452例)和胃癌(1 440例)。數(shù)據(jù)來源包括GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫。該工具基于薈萃分析，可發(fā)現(xiàn)和驗證生存生物標志物(survival biomarkers)[8]。本研究應用Kaplan-Meier Plotter分析不同CBX基因mRNA表達對肺腺癌預后的價值。在Kaplan-Meier繪圖儀(K-M繪圖儀)上，根據(jù)mRNA水平的中位數(shù)將腫瘤患者分為CBX高表達組和CBX低表達組，并用K-M生存曲線進行驗證。在K-M繪圖儀網(wǎng)頁上可以找到有關危險病例數(shù)、mRNA表達水平中位數(shù)、風險比(hazard ratio，HR)、95%置信區(qū)間(confidence interval，95%CI)和P值等信息，當P<0.05時，則視為具有顯著性差異。

2 結果

2.1 多種腫瘤的腫瘤組織和正常組織的CBX mRNA表達有顯著差異

ONCOMINE數(shù)據(jù)庫資料顯示，在20種腫瘤中，CBX家族成員mRNA在腫瘤組織中的表達與正常組織有差異。其中，肺癌尤其是肺腺癌這一類型組織的CBX1、CBX3、CBX4和CBX5的mRNA表達顯著高于正常組織(見圖1和表1)，而肺癌組織CBX7的mRNA表達顯著低于正常組織 (見圖1)。

2.2 CBX家族各個成員在原發(fā)性肺腺癌組織中mRNA表達水平不同

UALCAN數(shù)據(jù)庫資料也同樣顯示，與正常肺組織相比，原發(fā)性肺腺癌組織的CBX1、CBX2、CBX3、CBX4、CBX5和CBX8的mRNA表達均顯著上調(圖2A～2E，2H)，而CBX6和CBX7 mRNA表達均顯著下調(圖2F，2G)。

2.3 CBX家族的不同成員在原發(fā)性肺癌組織中蛋白表達水平的差異

Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫資料顯示，CBX2、CBX4、CBX5、CBX6和CBX8蛋白在正常肺組織中不表達或低表達，而在肺癌組織中觀察到低和中等表達(圖3B，3D～3F，3H)。此外，CBX1和CBX3蛋白在正常肺組織中呈低表達或中等表達，而在肺癌組織中呈中等表達或高表達(圖3A，3C)。然而，無論是在正常肺組織或肺癌組織中，CBX7蛋白的表達都很低(圖3G)。

2.4 CBX mRNA表達水平與肺腺癌患者的AJCC-TNM臨床分期顯著相關

采用UALCAN分析顯示，CBX家族成員的mRNA表達與患者個體腫瘤分期顯著相關。隨著腫瘤病理分期的增加(1期～4期)，CBX1、CBX2、CBX3、CBX4、CBX5和CBX8的mRNA的表達也趨于更高(圖4A～4E、4H)。CBX6，CBX7的mRNA表達水平隨著腫瘤分期的增加而趨于降低(圖4F、4G)，其中，CBX7 mRNA降低幅度更為顯著。

注：數(shù)據(jù)來源：UALCAN； Normal：正常組織； Primary tumor：肺腺癌組織； n：病例數(shù)圖2 不同CBXs家族成員在肺腺癌組織及癌旁正常肺組織中的mRNA表達

注：數(shù)據(jù)來源Human Protein Atlas；Normal：正常組織；Cancer：肺癌組織；藍色虛線區(qū)域：CBXs蛋白表達陽性圖3 CBXs家族各成員在肺癌組織和正常肺組織中的典型免疫組化圖像

注：數(shù)據(jù)來源：UALCAN；Normal：正常組織；n：病例數(shù)；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖4 CBXs家族各成員的mRNA在肺腺癌不同臨床分期中的表達水平

2.5 CBX家族成員的mRNA表達與肺癌患者OS顯著相關

CBX2、CBX4和CBX8 mRNA表達高的患者OS較短，(圖5B，CBX2：HR =1.55，95%CI：1.31～1.83，P<0.01；圖5D，CBX4：HR=1.22，95%CI：1.08～1.39，P<0.01；圖5H，CBX8：HR=1.18，95% CI：1.04～1.34，P<0.05)。CBX7 mRNA高表達的肺癌患者OS良好，呈顯著相關(圖5G，HR=0.57，95%CI：0.5～0.65，P<0.01)。然而，CBX1，CBX3，CBX5和CBX6的 mRNA表達與肺癌患者的預后無關(圖5A，CBX1：HR=0.89，95%CI：0.78～1.01，P=0.063; 圖5C，CBX3：HR=1，95%CI：0.88～1.14，P=0.99；圖5E, CBX5：HR=0.89，95%CI：0.79～1.02，P=0.085；圖5F，CBX6：HR=0.98，95%CI：0.86～1.11，P=0.75)。

注：數(shù)據(jù)來源：Kaplan-Meier Plotter；Logrank檢驗對肺癌患者進行生存分析，比較CBXs高表達組和低表達組患者OS；橫坐標：生存時間；縱坐標：生存率；紅線：CBXs高表達組；黑線：CBXs低表達組；low和high后面的數(shù)字代表橫坐標各時間段相對應的患者例數(shù)。ID：各基因對應的探針號； HR：風險比，HR>1，危險因素；HR<1，保護因素圖5 CBXs家族成員mRNA表達對肺癌患者預后的影響

3 討論

目前，影像學檢查、腫瘤標志物檢查是無創(chuàng)篩查肺癌，評價及監(jiān)測治療效果的主要方法。然而，普通CT對早期肺癌或者復發(fā)轉移灶敏感性較低。血清腫瘤標志物CEA、CYFRA21-1和NSE均對肺癌的診斷有一定的提示作用，亦可作為術后、化療后檢測腫瘤是否復發(fā)的指標，但會因為良性腫瘤、妊娠、慢性炎癥性疾病或其他因素而出現(xiàn)假陽性，其結果往往不太可靠[9]。因此，尋找更合適的、非侵襲性生物標志物來預測肺癌發(fā)生或評估預后，對肺癌的臨床治療具有重要的指導意義。多項研究證實，CBX在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用[10-12]，但CBX家族中不同的成員在肺癌發(fā)病機制中的作用卻不太相同，龐雜繁冗的數(shù)據(jù)模糊了CBX作為肺癌生物標志物的意義。因此，本研究對有關CBX和肺癌的海量數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，闡明了不同基因型CBX在肺腺癌中的表達情況及預后價值。

通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在肺癌患者中，CBX1、CBX2、CBX3、CBX4、CBX5和CBX8均存在mRNA過度表達，但其中僅有CBX1、CBX3、CBX4、CBX5和CBX8蛋白過度表達，而CBX2蛋白并沒有過表達，這可能是其轉錄后修飾受到限制。其次，部分CBX mRNA表達與肺癌患者的個體腫瘤分期顯著正相關，表達越高，腫瘤分期越晚。此外，高表達的CBX2、CBX4和CBX8與肺癌患者的短OS顯著相關，提示預后差；而高表達的CBX7與肺癌患者的良好OS顯著相關，提示預后相對良好。

除了肺癌，CBX成員在其他腫瘤中也顯示出其與患者的OS、腫瘤分期的顯著相關性，與本研究中有關CBX與肺腺癌關系的趨勢基本一致。部分研究還探討了相關的機制，例如，在前列腺癌的治療中，根據(jù)患者的Gleason分級(一種廣泛使用的組織分級方法)決定選取何種治療方案，而前列腺癌組織的CBX1表達水平增高與患者Gleason評分密切相關[13]。其機制可能為，前列腺癌組織的CBX1表達水平受到抑制后，癌細胞生長周期被阻滯在G1期，從而抑制癌細胞的生長[13]。在乳腺癌中，CBX1的過度表達也提示乳腺癌分化不良和患者預后差[14]。此外，乳腺癌和白血病細胞中也存在CBX2的過度表達現(xiàn)象，并且CBX2水平也與腫瘤轉移進展和患者短OS顯著相關[15]，CBX2基因還能增強白血病細胞的致瘤性和自我更新能力[16]。CBX3在人結直腸癌中過度表達，它通過直接調控CDKN1A分子，促使組蛋白H3K9啟動子甲基化，促進結腸癌細胞增殖[17]。在肝細胞癌中，CBX4在肝癌組織中高表達，并且和多種臨床參數(shù)有關，包括甲胎蛋白水平、腫瘤大小、病理分化、患者OS和無復發(fā)生存率(recurrence-free survival，RFS)[18, 19]。在本研究中也我們發(fā)現(xiàn)，CBX4在肺腺癌中具有類似的效應。同時，CBX8作為一個癌基因可以上調EGR1和miR-365-3p，從而激活AKT/β-catenin通路，促進腫瘤的生長和轉移，而沉默CBX8基因表達則抑制了上述效應[20]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CBX8和上述CBX成員一樣，其mRNA和蛋白表達顯著增高，并且CBX8的mRNA表達與患者的腫瘤分期顯著相關。

研究發(fā)現(xiàn)，CBX6在肝癌臨床樣本和肝癌細胞系中上調，并且CBX6的表達與較大的腫瘤(直徑≥5 cm，P=0.011)和多發(fā)性腫瘤(n≥2，P=0.018)顯著相關；生存分析表明，與低表達CBX6的患者相比，CBX6表達水平高的患者RFS和OS顯著縮短，多變量分析證實CBX6表達增加是肝癌患者的獨立不利預后因素；功能研究表明，CBX6在體外和體內均能顯著促進肝癌細胞的生長；其機制研究表明S100A9/NF-κB/MAPK通路是介導CBX6功能的重要途徑[21]。CBX6的過度表達促進了腫瘤的進展，并預示著肝細胞癌預后不良。另外有研究在TCGA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，CBX6在多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)中表達下調，并且其表達量與腫瘤分期呈負相關[22]。在GBM細胞系中過表達CBX6，發(fā)現(xiàn)細胞增殖受到抑制[22]。上述研究提示，CBX6在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中呈現(xiàn)出不同的功能。

有趣的是，CBX7低表達預示肺癌患者有更好的生存率。CBX7是腫瘤相關研究中最具特征的CBX蛋白[23]。研究顯示CBX7可通過抑制PTEN/AKT信號轉導拮抗胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲[24]。另有文獻報道，采用qRT-PCR、IHC以及Log-rank分析等方法對浸潤性乳腺癌進行多變量分析，結果表明只有EZH2過表達和CBX7低表達與乳腺癌短無轉移生存率(metastase-free survival，MFS)顯著相關， EZH2過表達和CBX7低表達同時存在可作為一個獨立的預后因素[25]。CBX7亦可通過DKK-1介導的Wnt信號通路抑制乳腺腫瘤的發(fā)生。這些研究都提示，在部分腫瘤中(包括本研究關注的肺腺癌)，CBX7可能是一種重要的腫瘤抑制因子[26]。但是，該觀點在甲狀腺癌和胰腺癌中卻不成立，因為CBX7表達缺失的甲狀腺癌和胰腺癌組織具有高度惡性表型[27]。此外，還發(fā)現(xiàn)上調CBX7表達可提高人類肺癌細胞對伊立替康治療的敏感性，提示其可能是提高化療療效的一個潛在措施[28]?？傊?，關于CBX7的生物功能，在不同腫瘤中具有明顯差異，提示CBX7可能同時存在抑癌或致癌功能，這取決于腫瘤類型、腫瘤微環(huán)境和各種蛋白之間的相互作用。

綜上，檢測患者肺組織CBX mRNA水平可以作為肺腺癌患者生存期預測的生物學指標，尤其以CBX2、CBX4和CBX8更有意義，它們的高表達與肺癌患者的短OS顯著相關，提示預后差；而CBX7表達水平高與肺癌患者的良好OS顯著相關，提示預后相對良好。同時，CBX7高表達還提示患者采用伊立替康治療時會有更好的療效。CBX1、CBX3、CBX5和CBX6的mRNA表達與肺癌患者的預后無關。因此，在CBX蛋白家族中，聯(lián)合檢測CBX2、CBX4、CBX7和CBX8 表達水平，對肺癌患者生存預后有更好的評估價值，亦可作為個體化治療的潛在靶點。本研究分析的結果將有助于更好地理解肺癌分子生物學的復雜性和異質性，并為后續(xù)深入研究提供方向。