李紅君 鄭麗端

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 病理科， 湖北 武漢 430022)

胃癌是全球腫瘤死亡的第三大原因，嚴(yán)重威脅人類健康。尋找胃癌早期診斷的特異性標(biāo)記物和新的治療靶點是當(dāng)前的研究熱點[1]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，RNA結(jié)合蛋白核不均一核糖核蛋白U(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U, HNRNPU)在胃癌組織中高表達(dá)，HPSE eRNA/HNRNPU/p300/EGR1/HPSE軸可以作為胃癌臨床治療的潛在靶標(biāo)[2]。但是HNRNPU對胃癌增殖侵襲的直接作用沒有進行深入探討。本研究擬探討過表達(dá)或敲低HNRNPU對胃癌細(xì)胞增殖侵襲等生物學(xué)功能的影響，通過對公用數(shù)據(jù)庫的綜合分析，挖掘HNRNPU可能調(diào)控的靶基因以及生物學(xué)過程。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

人胃癌細(xì)胞系MGC-803來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，且具備細(xì)胞STR鑒定報告。

1.1.2 實驗試劑

RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基(美國Thermo公司)；胎牛血清(美國Thermo公司)；青-鏈霉素溶液(美國Thermo公司)；胰酶(武漢谷歌生物公司)；PBS緩沖液(武漢谷歌生物公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(日本TaKaRa公司)；2×Taq Master Mix(南京諾唯贊公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；Neofect轉(zhuǎn)染試劑(北京零客創(chuàng)智生物公司)；Matrix基底膜基質(zhì)膠(美國BD公司)；抗體(愛博泰克生物公司)。引物由武漢擎科生物公司合成(表1)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

采用RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1%青-鏈霉素溶液)培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞系MGC-803，培養(yǎng)條件為37℃恒溫、5%的CO2。人類HNRNPU真核表達(dá)載體及RNA干擾載體購自上海吉凱基因科技有限公司。將細(xì)胞用胰酶消化并接種于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)60%～70%，處于對數(shù)增長期時行轉(zhuǎn)染實驗。轉(zhuǎn)染體系為：200 μL無血清培養(yǎng)基，2 μg質(zhì)粒和2 μL Neofect轉(zhuǎn)染試劑。培養(yǎng)48 h后，給予嘌呤霉素進行篩選，獲得HNRNPU穩(wěn)定過表達(dá)或敲低的細(xì)胞株。穩(wěn)篩細(xì)胞株用于后續(xù)實驗。

1.2.2 Western Blot

收集處理后的細(xì)胞，制備蛋白樣品，BCA法測定蛋白濃度，按照每孔30 μg上樣。80 V恒壓電泳至蛋白Maker分開，120 V恒壓電泳1 h左右。300 mA恒流冰浴轉(zhuǎn)膜1 h，封閉后，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，使用UVP凝膠成像系統(tǒng)顯像。

1.2.3 實時定量PCR

采用Trizol法抽提細(xì)胞樣品中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在冰上配置實時定量PCR的反應(yīng)體系，加入96孔PCR檢測板后上機。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，5 min；變性95℃，10 s；退火50～65℃，10 s；延伸72℃，延伸時間根據(jù)產(chǎn)物長度調(diào)整；循環(huán)重復(fù)擴增30～40次；以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算。

1.2.4 MTT

取處于對數(shù)生長期的穩(wěn)篩細(xì)胞，以合適的密度接種于96孔板，分別在相應(yīng)的觀察時間點(24 h、48 h、72 h以及96 h)更換培養(yǎng)基，每孔加入20 μL的 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，棄去上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，震蕩10 min。使用酶聯(lián)免疫檢測儀測量490 nm處各孔的吸光值。

1.2.5 軟瓊脂克隆形成實驗(Soft Agar Assay)

將1.2%的瓊脂糖液和2×DMEM(加入2×抗生素和20%的胎牛血清)等比例混合，6孔板的每個孔中加入3 mL，冷卻凝固形成下層瓊脂凝膠。等比例配置0.5%的瓊脂糖液和上述2×DMEM完全培養(yǎng)基，待冷卻至35～40℃時，迅速加入200 μL細(xì)胞懸液，輕柔混勻后，各取3 mL加入上述已經(jīng)冷卻的下層凝膠之上。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周后，MTT染色，計數(shù)克隆形成數(shù)量。

1.2.6 基質(zhì)膠侵襲實驗(Transwell)

向24孔板的每個孔中加入500 μL完全培養(yǎng)基，將基質(zhì)膠包被的Transwell小室放入孔中。向小室內(nèi)加入用無血清重懸的細(xì)胞懸液(1×104個)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棉簽輕柔擦去上室內(nèi)的細(xì)胞后，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下拍照計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有的數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用t檢驗分析兩組之間的差異。利用Pearson相關(guān)系數(shù)測定法分析兩個基因之間的表達(dá)相關(guān)性。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HNRNPU促進胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲

通過實時定量RCR和Western Blot，分別在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上證實了HNRNPU在體外能夠被有效地過表達(dá)或敲低(見圖1)。MTT、軟瓊脂克隆形成和基質(zhì)膠侵襲實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達(dá)HNRNPU能夠顯著地提高胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲活性；反之，敲低HNRNPU則明顯地抑制了胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲(見圖2～4)。上述結(jié)果提示，HNRNPU是胃癌發(fā)生發(fā)展中重要的促癌分子。

注：A：MGC-803細(xì)胞系穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體(Mock)或HNRNPU，與Mock相比，*P<0.05；B：MGC-803細(xì)胞系穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對照組(sh-Scb)或sh-HNRNPU，與sh-Scb組相比，*P<0.05圖2 MTT檢測HNRNPU對胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響

注：A：MGC-803細(xì)胞系穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體(Mock)或HNRNPU；B：MGC-803細(xì)胞系穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對照組(sh-Scb)或sh-HNRNPU；兩組間比較，***P<0.001圖4 Transwell檢測HNRNPU對胃癌細(xì)胞MGC-803侵襲的影響(結(jié)晶紫染色)

2.2 HNRNPU在胃癌中調(diào)控衰老相關(guān)基因

為了進一步探索HNRNPU調(diào)控胃癌發(fā)生發(fā)展可能的分子機制，我們進行了數(shù)據(jù)庫的挖掘和分析。通過解析GEO公用數(shù)據(jù)庫，我們分析了敲低HNRNPU后腫瘤細(xì)胞的RNA-seq測序數(shù)據(jù)(GSE 88498和GSE 88178)，與對照組測序數(shù)據(jù)(GSE 88272和GSE 88174)進行比對，得到了表達(dá)水平一致變化的8155個差異基因[3]。結(jié)合ENCORI數(shù)據(jù)庫[4]中HNRNPU靶向的mRNA做重合分析，我們獲取了HNRNPU可能調(diào)控的3 737個靶基因(見圖5)。應(yīng)用在線工具KOBAS[5]對這些變化基因進行通路富集分析，我們發(fā)現(xiàn)這些基因參與許多腫瘤相關(guān)信號通路和生物學(xué)過程，其中有41個靶基因與細(xì)胞衰老相關(guān)(見圖5)。

圖5 數(shù)據(jù)庫分析HNRNPU可能調(diào)控的下游靶基因以及HNRNPU下游靶標(biāo)基因富集分析

通過深入挖掘CSGene數(shù)據(jù)庫[6]，我們明確了14個HNRNPU調(diào)控的已有文獻(xiàn)報道的衰老相關(guān)靶基因。運用GEO數(shù)據(jù)庫中胃癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集(GSE15459)，進一步分析這14個基因的表達(dá)水平與生存的相關(guān)性，篩選出與胃癌患者生存密切相關(guān)的7個基因(見圖6)?；赗NA-seq表達(dá)水平、生存相關(guān)性以及與HNRNPU表達(dá)相關(guān)性的一致性分析，我們最終確定了在胃癌中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinase 2, CDK2)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin kinase, MTOR)可能是HNRNPU調(diào)控衰老的重要靶基因[7-10](見圖6和7)。

圖6 衰老相關(guān)靶基因與胃癌患者生存的關(guān)系

2.3 HNRNPU促進CDK2在胃癌細(xì)胞中表達(dá)

基于上述分析，我們認(rèn)為RNA結(jié)合蛋白HNRNPU通過調(diào)控CDK2和MTOR的表達(dá)，抵抗胃癌細(xì)胞衰老，從而促進胃癌的發(fā)生和進展。為了驗證這一假設(shè)，我們使用過表達(dá)或敲低HNRNPU的穩(wěn)篩細(xì)胞株，利用實時定量RCR和Western Blot，在mRNA和蛋白水平上檢測了CDK2和MTOR的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，在胃癌中，CDK2與HNRNPU的表達(dá)水平保持一致，而MTOR的表達(dá)不受影響(見圖8)。因此，CDK2是HNRNPU發(fā)揮作用的重要靶基因。

注：MGC-803細(xì)胞系穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對照載體(Mock或sh-Scb)、HNRNPU或sh-HNRNPU，實時定量PCR(A)和Western Blot(B)分別在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測過表達(dá)或敲低HNRNPU對胃癌細(xì)胞MGC-803靶基因表達(dá)水平的影響；兩組間比較，***P<0.001圖8 PCR和Western Blot檢測HNRNPU對胃癌細(xì)胞MGC-803靶基因表達(dá)水平的影響

3 討論

胃癌是全球腫瘤發(fā)病率排名第五、死亡率高居第三的惡性腫瘤，在亞太地區(qū)尤其是中國死亡率更高[1]。胃癌發(fā)病隱匿，早期診斷困難，易于侵襲轉(zhuǎn)移，因而積極探索胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找新的診斷標(biāo)記物和治療靶點具有重要的臨床意義。

HNRNPU是核不均一核糖核蛋白家族(HNRNPs)的重要成員[11, 12]，參與選擇性剪切[13]、RNA加工修飾運輸、轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控[14, 15]、DNA損傷修復(fù)等重要生物學(xué)過程[16]。HNRNPU的異常表達(dá)與胃癌[2]、肺癌[17]、肝癌[18]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[19]等多種腫瘤的侵襲進展以及患者不良預(yù)后密切相關(guān)。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，HNRNPU在發(fā)生局部浸潤、淋巴結(jié)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌患者的組織標(biāo)本中表達(dá)升高，具有重要的臨床診斷和治療意義[2]。作為RNA結(jié)合蛋白，HNRNPU可以與一種組蛋白乙酰化酶p300相互作用，富集于超級增強子，促進超級增強子與啟動子之間染色質(zhì)環(huán)的形成，進而促進靶基因的表達(dá)[2]。但是目前在胃癌中，HNRNPU調(diào)控的生物學(xué)過程鮮有報道。

本研究通過體外功能實驗，發(fā)現(xiàn)HNRNPU表達(dá)上調(diào)會促進胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。通過整合紫外交聯(lián)免疫沉淀測序(crosslinking-immunoprecipitation and high-throughput sequencing, CLIP-seq)數(shù)據(jù)和敲低HNRNPU后的差異表達(dá)基因，結(jié)合通路分析發(fā)現(xiàn)，HNRNPU調(diào)控衰老相關(guān)基因，影響細(xì)胞衰老的生物學(xué)過程。細(xì)胞衰老是具有增殖能力的細(xì)胞在遭受到端粒功能障礙、氧化應(yīng)激、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化、蛋白毒性等應(yīng)急信號時誘發(fā)的一種細(xì)胞周期停滯的狀態(tài)[20]。衰老細(xì)胞的特征是發(fā)生形態(tài)變化，染色質(zhì)重塑和代謝重編程，基因表達(dá)改變以及出現(xiàn)一種稱為衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)的促炎癥表型[21]。細(xì)胞衰老與腫瘤之間的關(guān)系具有兩面性，衰老可以作為一種有效的抑癌機制，衰老細(xì)胞和SASP會造成局部或全身性炎癥，破壞正常組織結(jié)構(gòu)和功能，促進腫瘤的惡性表型、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)[22]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌中，HNRNPU與衰老相關(guān)基因CDK2的表達(dá)水平呈正相關(guān)。HNRNPU通過對抗腫瘤細(xì)胞的衰老，促進胃癌的增殖和侵襲。但是對于HNRNPU如何調(diào)控CDK2的表達(dá)，如何調(diào)控細(xì)胞衰老進而促進胃癌進展，都有待進一步研究探討。相信隨著對胃癌發(fā)生機制研究的不斷深入，胃癌的早期診斷和靶向治療會迎來新的突破。