帥 維 張 偉 范致星

(武漢大學 人民醫(yī)院 心血管內科， 湖北 武漢 430061)

動脈粥樣硬化等阻塞性血管疾病的發(fā)生發(fā)展與血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的遷移密切相關[1]?，F(xiàn)有研究表明，VSMCs的遷移水平受細胞內外多種生物學信號的調節(jié)，其中炎癥通路的激活發(fā)揮了至關重要的作用[2]。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中最重要的炎癥遞質，可以誘導動脈粥樣硬化斑塊中多種炎癥因子的表達[3,4]。Ang Ⅱ作為一種化學誘導物[5]，可通過結合AngⅡ-1型受體(Ang Ⅱ-type 1 receptor，AT1R)，激活細胞內的信號轉導通路(如MAPK、JNK、NF-κB)，誘導免疫和炎癥反應，進而刺激VSMCs遷移[6]。但由于AT1R下游分子信號復雜，涉及多種調控通路，Ang Ⅱ促VSMCs遷移的具體分子機制仍未完全闡明。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Akt)是參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要信號通路，在調控VSMCs功能狀態(tài)中發(fā)揮重要作用[7]。PI3K/Akt通路同時受到了多種上游信號分子的調控，研究表明AT1R與PI3K/Akt通路亦有交互效應[8,9]。因此，本實驗將通過體外培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMCs，以探討AT1R依賴的PI3K/Akt通路激活是否參與了AngⅡ介導的VSMCs遷移。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

重組人Ang Ⅱ(Sigma公司)；脂質體2000轉染試劑(Invitrogen公司)；PI3K抑制劑(LY294002，Calbiochem公司)；Akt抗體和磷酸化Akt抗體(Cell Signaling 公司)；Control siRNA、AT1R siRNA、AT1R抗體、PI3K抗體和GAPDH 抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 VSMCs的培養(yǎng)、鑒定

取雄性SD大鼠(約150 g)的胸主動脈，分離培養(yǎng)原代VSMCs。DMEM培養(yǎng)基中加入青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)，于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取3～5代VSMCs用于后續(xù)研究。根據(jù)細胞形態(tài)學及特異抗體SM-α-Actin對VSMCs進行鑒定。

1.3 細胞活性測定

采用不同濃度的Ang Ⅱ(0.1～1000 ng/mL)刺激VSMCs，然后用0.4%臺盼藍染液處理Ang Ⅱ刺激后的VSMCs，5 min后光鏡下觀察細胞染色情況。未染色細胞占總細胞數(shù)的比例即細胞活性，用于評估Ang Ⅱ對于VSMCs的細胞毒性。

1.4 細胞遷移實驗

Transwell小室的上室接種胰酶消化后的VSMCs(密度約5×104/孔)；下室加入含0.1～1 000 ng/mL濃度梯度的Ang Ⅱ，37℃的5% CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h。取出濾膜，甲醇固定并蘇木素染色，光鏡下觀察遷移到濾膜下室面的VSMCs并計數(shù)。

1.5 實驗分組

分為Control對照組、AT1R siRNA轉染組、Control siRNA轉染組和PI3K抑制劑(LY294002)干預組。運用Lipofectamine 2000將等量的AT1R siRNA或Control siRNA轉染至VSMCs，48 h后RT-PCR與Western blot檢測AT1R的表達情況。

1.6 RT-PCR檢測AT1R基因的表達

Trizol法抽提總RNA，并逆轉錄成cDNA。RT-PCR由ABI Prism7500完成，RT-PCR 反應條件為95℃ 10 s，60℃ 10 s，75℃ 20 s；共40個循環(huán)，使用2-ΔΔCt方法進行結果分析。實驗中所用引物序列如下：

AT1R：上游5′-AAGGGCTACCAGAGCGATCA-3′，下游5′-GGTATTGCCAGGTGCACAAA-3′；

GAPDH：上游5′-GACAACTTTGGCTCGTGGA-3′，下游5′-ATGCAGGGGTTCTGG-3′。

1.7 Western blot檢測相關蛋白的表達

PBS洗滌細胞后，提取細胞蛋白，凝膠電泳后將蛋白轉移至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉封閉后，加入AT1R、磷酸Akt(Ser-473)、Akt及GAPDH的一抗4℃孵育過夜，漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗進行孵育。采用ECL化學發(fā)光檢測試劑盒進行顯影，并采集圖像。

1.8 PI3K的活性測定

100 ng/mL的Ang Ⅱ處理AT1R siRNA和Control siRNA轉染后的VSMCs， 6 h后裂解VSMCs并測定PI3K活性[10]。在各組樣本(500 μg)中加入PI3K抗體4℃孵育過夜。將獲得的免疫復合物采用蛋白瓊脂糖小體處理2 h，離心后收集樣本。采用競爭性ELISA試劑盒檢測PI3K的活性。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示。組間比較采用單因素方差分析，各組間的兩兩比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Ang Ⅱ對VSMCs遷移的影響

顯微鏡下觀察到VSMCs呈典型的“峰谷”樣生長。SM-a-Actin免疫染色證實細胞純度大約為90%。細胞活性證實，0.1～1000 ng/mL的Ang Ⅱ未對VSMCs造成細胞毒性(見圖1A)。Ang Ⅱ可明顯促進VSMCs遷移(均P<0.05)，且VSMCs遷移效應在Ang Ⅱ濃度為100 ng/mL時達到最大(見圖1B)。

2.2 AT1R在Ang Ⅱ介導VSMCs遷移中的作用

為探討AT1R在Ang Ⅱ介導VSMCs遷移中的作用，本實驗首先用AT1R siRNA轉染VSMCs 48 h，然后用Ang Ⅱ(100 ng/mL)刺激12 h。檢測發(fā)現(xiàn)，AT1R siRNA組中的AT1R表達水平顯著下降(P<0.05，見圖2A)，Ang Ⅱ誘導的VSMCs遷移也明顯受抑(見圖2B)。

注：A：細胞活性實驗檢測0.1～1000 ng/mL的Ang Ⅱ對VSMCs的細胞毒性作用；B：Transwell小室法檢測0.1～1 000 ng/mL的Ang Ⅱ對VSMCs遷移的影響；與對照組相比，*P<0.05圖1 Ang Ⅱ對VSMCs遷移的影響

注：A：Control siRNA和AT1R siRNA轉染VSMCs 48 h后，RT-PCR和Western blot檢測AT1R的mRNA及蛋白表達水平，與Control siRNA轉染組相比，*P<0.05；B：Control siRNA或AT1R siRNA轉染VSMCs后， 100 ng/mL Ang Ⅱ刺激12 h后所測得的VSMCs遷移活性。與Control組相比，*P<0.05；與AngⅡ+ Control siRNA轉染組相比，#P<0.05圖2 AT1R在AngⅡ介導VSMCs遷移中的作用

2.3 PI3K/Akt信號通路在AngⅡ介導VSMCs遷移中的作用

VSMCs經100 ng/mL的 AngⅡ處理后，PI3K活性和Akt(Ser-473)磷酸化水平均顯著增加(均P<0.05)。但Ang Ⅱ刺激AT1R siRNA預先處理的VSMCs，PI3K/Akt信號通路卻被明顯抑制(P<0.05，見圖3)。上述結果提示，Ang Ⅱ可能依賴AT1R激活PI3K/Akt信號通路而介導VSMCs遷移。

2.4 PI3K在AngⅡ介導Akt 激活和VSMCs遷移中的作用

上述結果已表明PI3K與VSMCs的遷移有關。為進一步驗證PI3K參與了AngⅡ介導的Akt激活和VSMCs遷移，我們用Ang Ⅱ刺激經PI3K抑制劑LY294002(10 μM)預處理后的VSMCs。結果表明，LY294002預處理能抑制Akt磷酸化活化(P<0.05，圖4A)，同時能明顯拮抗VSMCs遷移(P<0.05，圖4B)。上述結果進一步證實，PI3K在AngⅡ介導的Akt活化和VSMCs遷移中發(fā)揮重要作用。

注： A：PI3K的活性測定；B：總Akt及磷酸化Akt(Ser-473)的表達水平。與Control組相比，*P<0.05；與An gⅡ+ Control siRNA轉染組相比，#P<0.05圖3 AngⅡ通過AT1R激活PI3K/Akt途徑介導VSMCs遷移

注：A：LY294002對Akt(Ser-473) 磷酸化水平的影響；B：LY294002對Ang Ⅱ介導VSMCs遷移的影響。與Control組相比，*P<0.05；與Ang Ⅱ組相比，#P<0.05圖4 LY294002抑制Ang Ⅱ介導的Akt磷酸化和VSMCs遷移

3 討論

動脈粥樣硬化等阻塞性血管疾病涉及多種細胞、多種因子的參與，其中VSMCs的遷移是該類疾病發(fā)生的病理基礎。VSMCs的病理性活化促進動脈粥樣硬化斑塊的進展和最終斑塊的破裂。研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化等阻塞性血管疾病患者體內Ang Ⅱ的水平明顯升高，而Ang Ⅱ的上升，一方面能夠通過促進血管內皮細胞的損傷，增加內皮下膠原成分的暴露，促進粥樣斑塊的形成；另一方面，Ang Ⅱ還能通過激活其受體AT1R介導的炎癥反應來促進VSMCs的遷移，加速粥樣斑塊的形成[11,12]。

既往研究表明，抑制目前已證實的炎癥相關信號通路并不能完全有效地抑制Ang Ⅱ介導的VSMCs遷移，提示有更多未闡明的分子通路參與了此過程[13]。因此，有必要更加深入探究Ang Ⅱ介導VSMCs遷移的分子機制。PI3K/Akt信號通路作為一種經典的信號通路參與了多種病理生理過程，在細胞遷移、增殖等過程中發(fā)揮了重要作用，已有研究證實其與動脈粥樣硬化疾病密切相關[10]。Akt作為PI3K下游信號分子，可被PI3K磷酸化，磷酸化的Akt又可介導VSMCs遷移[14]，同樣有研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt也是AT1R下游信號通路[8,9]。鑒于已有研究，我們推測：Ang Ⅱ與AT1R結合后可通過激活PI3K/Akt介導VSMCs遷移。本研究結果表明，VSMCs在Ang Ⅱ處理后遷移能力顯著增加，而AT1R siRNA可顯著抑制該效應，這與已有的結果一致，證實AT1R參與了這一過程。與此同時，我們還發(fā)現(xiàn)AT1R siRNA處理后，VSMCs的PI3K活性和Akt磷酸化亦被明顯抑制。而且，LY294002抑制PI3K后，VSMCs遷移能力及Akt的磷酸化均可被抑制。因此，Ang Ⅱ可通過激活AT1R/PI3K/Akt信號通路介導VSMCs遷移。

然而，從已有的結果中我們還可以發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ介導的VSMCs遷移并不會因沉默AT1R或是抑制PI3K的表達而完全被抑制。由此，我們推測Ang Ⅱ介導的VSMCs遷移機制復雜，可能有多種的受體及信號通路參與其中，需要進一步研究證實。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ介導的VSMCs遷移與AT1R/PI3K/Akt信號通路的激活密切相關。相關研究結果進一步揭示了Ang Ⅱ介導VSMCs 遷移的分子機制，也為阻塞性血管疾病的治療提供了新靶點和新思路。