張韶湘 鄒昱蕾 李江 余曉玲 陳凌云
摘要:目的 建立養(yǎng)血生發(fā)合劑的質量標準。方法 采用TLC對本品中當歸、補骨脂進行定性鑒別。采用HPLC對本品中大黃素進行含量測定。采用單因素試驗法,對含量測定中供試品溶液的前處理方法進行考察。結果 可檢出當歸和補骨脂且陰性無干擾。大黃素在6.17~79.35 μg/mL范圍內線性關系良好,回歸方程為y=34.43x+5.31(R2=0.999 8),平均加樣回收率為103.42%(RSD=2.16%,n=6),其余方法學考察項均合格。結論 所建立的質量標準可以用于養(yǎng)血生發(fā)合劑的質量控制。
關鍵詞:養(yǎng)血生發(fā)合劑;質量標準;薄層鑒別;含量測定;大黃素
中圖分類號:R285.5 文獻標志碼:A 文章編號:1007-2349(2021)03-0072-04
養(yǎng)血生發(fā)合劑是昆明市中醫(yī)醫(yī)院的院內制劑,運用于臨床長達30余年。該制劑由制何首烏、當歸、補骨脂(鹽)、菟絲子(鹽)、牛膝、茯苓共6味藥經提取后制備而成,具有養(yǎng)血生發(fā)、烏須發(fā)的功效,用于腎氣不足、氣血虧虛所致的須發(fā)脫落、早白。方中制何首烏為君藥,具有補肝腎、強筋骨、益精血、烏須發(fā)的功效,所含蒽醌類成分大黃素具有抗衰老、保護肝腎、增強免疫力等作用[1-3],其余當歸、補骨脂(鹽)、菟絲子(鹽)等藥材亦具有保肝強腎、抗衰老、抗氧化、增強免疫功能等效果[4-6]。
由于該合劑現(xiàn)行質量標準內容過于簡單,檢查項目專屬性不強,且沒有含量測定項,很難實現(xiàn)對該制劑的質量控制。因此,本研究采用TLC法對方中各藥味進行定性鑒別研究,以建立快速、靈敏、專屬性強的定性鑒別方法;同時,采用單因素試驗法,對含量測定中供試品溶液的制備條件進行考察,以確定適宜的供試品溶液制備方法,并采用HPLC法建立養(yǎng)血生發(fā)合劑中主要有效成分大黃素的含量測定方法,為養(yǎng)血生發(fā)合劑的質量控制提供依據。
1 儀器與試藥
1.1 儀器 1100系列高效液相色譜儀(Agilent公司);T-1000型電子天平(美國雙杰兄弟有限公司);Diamonsil C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm,迪馬科技公司);AB265-SMETTLER TOLEDO分析天平(瑞士梅特勒-托利多集團);硅膠G板(青島海洋化工分廠、青島鼎康硅膠有限公司);點樣毛細管(國藥集團化學試劑有限公司)。
1.2 試藥 當歸對照藥材(批號:120927-201617),補骨脂對照藥材(批號:121056-201605),大黃素對照品(批號:110756-201512,含量以98.7%計)均購自中國食品藥品檢定研究院。養(yǎng)血生發(fā)合劑(批號:180811、180812、180813,由昆明市中醫(yī)醫(yī)院提供)。甲醇為色譜純,其余試劑均為分析純。
2 方法與結果
2.1 薄層鑒別
2.1.1 當歸的薄層鑒別 取本品20 mL,濃縮至約10 mL,加乙醚萃取2次,每次10 mL,合并萃取液,蒸干,殘渣加無水乙醇1 mL使溶解,作為供試品溶液[7]。取當歸對照藥材0.5 g,加乙醚20 mL,超聲處理10 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加無水乙醇1 mL使溶解,作為對照藥材溶液。取不含當歸的陰性樣品溶液,按上述供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液。按2015年版《中國藥典》(四部)通則0502進行試驗,以硅膠G板為吸附劑,對照藥材溶液、供試品溶液、陰性對照溶液點樣量各5、10、10 μL,以正己烷-乙酸乙酯(7:1)為展開劑,展開,待晾干后于365 nm紫外光燈下檢視。結果顯示,供試品色譜與對照藥材色譜相應位置上顯相同顏色的斑點,且陰性無干擾。結果見圖1。
2.1.2 補骨脂的鑒別 取本品20 mL,濃縮至約10 mL,加乙酸乙酯振搖提取2次,每次10 mL,合并乙酸乙酯液,蒸干,殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解,作為供試品溶液[8]。取補骨脂對照藥材0.2 g,加乙酸乙酯20 mL超聲提取10 min,濾過,料液蒸干,殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解,作為對照藥材溶液。取不含補骨脂的陰性樣品溶液,按上述供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液。按2015年版《中國藥典》(四部)通則0502進行試驗,以硅膠G板為吸附劑,各溶液點樣量均為10 μl。以正己烷-乙酸乙酯(4:1)為展開劑,展開,待晾干后,噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液,于365 nm紫外光燈下檢視。結果顯示,供試品色譜與對照藥材色譜相應位置上顯相同顏色的斑點,且陰性無干擾。結果見圖1。
2.2 大黃素含量測定
2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應性 以Diamonsil C18為色譜柱,甲醇-0.1%磷酸溶液(79:21)為流動相,254 nm為檢測波長,在30℃柱溫,10 μl進樣量,1.0 mL/min流速條件下檢測。理論板數按大黃素峰計算不低于5000,大黃素峰對稱因子在0.95~1.05內,且該峰與附近峰分離度≥1.57,陰性對照無干擾。結果見圖2。
2.2.2 對照品溶液的制備 取大黃素對照品適量,精密稱定,加甲醇制成40 μg/mL的溶液,即得。
2.2.3 供試品溶液的制備 精密移取本品30 mL,水浴蒸干,取8%鹽酸溶液20 mL分次加入蒸發(fā)皿中,溶解殘渣并洗滌蒸發(fā)皿,溶解液合并洗滌液,移置圓底燒瓶中,加三氯甲烷20 mL,水浴加熱回流3 h,取出,冷卻。用分液漏斗分取三氯甲烷層(取10 mL三氯甲烷分次洗滌燒瓶,洗液并入分液漏斗中),剩余鹽酸溶液再用三氯甲烷液萃取3次,每次15 mL,合并上述所有三氯甲烷液,減壓回收溶劑至干,殘渣加甲醇溶解定容至5 mL,即得。
2.2.4 陰性對照溶液的制備 取不含制何首烏的陰性樣品,按“2.2.3”項下方法制備陰性對照溶液。
2.2.5 線性關系及范圍考察 精密稱取大黃素對照品(含量以98.7%計)0.01005 g,置于25mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,取該溶液1mL,移至5mL量瓶中加甲醇定容,得濃度為79.35 μg/mL的溶液,取該溶液3mL,移至5mL量瓶中加甲醇定容,依次稀釋,得濃度為28.56,17.14,10.28,6.17 μg/mL的對照品溶液。分別吸取上述各溶液,按照“2.2.1”項下的條件檢測。以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程為y=34.43x+5.31(R2=0.999 8)。
2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下對照品溶液和“2.2.3”項下供試品溶液,按“2.2.1”項下條件,分別在0,4,8,12,16 h測定大黃素的峰面積,計算得對照品溶液峰面積的RSD=0.69%,供試品溶液峰面積得RSD=1.56%,表明二者的穩(wěn)定性符合方法學要求。
2.2.7 重復性試驗 取同一批次養(yǎng)血生發(fā)合劑6份,每份30mL,按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項下條件檢測,計算得大黃素平均含量為6.34 μg/mL,RSD=1.87%(n=6),表明該方法重復性好。
2.2.8 準確度試驗 取同一批次養(yǎng)血生發(fā)合劑(含量為6.34 μg/mL)6份,每份15 mL,分別加入濃度為44.29 μg/mL的大黃素對照品溶液各2 mL,按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,按”2.2.1”項下方法進樣測定,得平均加樣回收率是103.42%,RSD=2.16%(n=6),表明所建方法符合含量測定要求。結果見表1。
2.2.9 含量測定 取3批次養(yǎng)血生發(fā)合劑(批號見表2),每批次取2份藥液,按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項下方法檢測,計算大黃素含量。結果顯示,3批次養(yǎng)血生發(fā)合劑中大黃素平均含量為6.33 μg/mL,RSD =1.32%。結果見表2。
3 討論
本研究建立了養(yǎng)血生發(fā)合劑中當歸、補骨脂的TLC鑒別方法。同時,由于薄層鑒別常受點樣量、溫度、濕度、薄層板廠家、樣品批次等因素的影響,本研究依據《云南省中藥材(民族藥材)質量標準研究技術指導原則(試行)》對2藥的鑒別進行了方法學考察。結果表明,在15℃~25℃,50%~90%濕度,兩個不同廠家(青島海洋化工分廠、青島鼎康硅膠有限公司)薄層版條件下,3個批次養(yǎng)血生發(fā)合劑均可鑒別出當歸和補骨脂。方中其余4藥的TLC鑒別中,菟絲子、牛膝、茯苓均存在陰性干擾,何首烏中的大黃素已作為定量指標,故本研究并未建立何首烏及上述3味藥的TLC鑒別方法。
本文對含量測定中供試品溶液的前處理方法進行了較系統(tǒng)的研究。結果表明,是否進行水解、水解所用酸的種類、所用酸的用量、水解時間、水解后酸液的萃取次數、水解所用酸的濃度對大黃素的檢測均有影響,其中前4項影響較大,其余則影響較小。
本研究對當歸中的阿魏酸進行了含量測定研究,發(fā)現(xiàn)其存在陰性干擾且含量偏低。在對菟絲子中的金絲桃苷進行測定時,未能檢出金絲桃苷,推測可能與金絲桃苷在本合劑中的穩(wěn)定性不佳有關。同時,補骨脂中的補骨脂素亦存在陰性干擾,而異補骨脂則未能檢測到。牛膝中的β-蛻皮甾酮在原藥材中的含量較低(2015年版中國藥典規(guī)定應≥0.030%),考慮到處方藥材制備為口服液后所含含量更低,故不宜作為定量指標。剩余的茯苓在藥典中則無“含量測定”項,故本研究建立了何首烏中大黃素的含量測定方法。
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(收稿日期:2020-09-17)