王春林 田啟東 胡鸞 向勇 艾健 趙志勇 董有康

摘要：目的 研究拔伸松動手法對兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）模型兔關(guān)節(jié)液中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化脂質(zhì)（LPO）、丙二醛（MDA）的影響，探討拔伸松動法促進(jìn)兔KOA軟骨損傷修復(fù)的機(jī)制。方法 將80只健康成年家兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對照組、模型組、空白組，每組20只。除空白組外，其余各組采用Videman T法建立KOA模型。實(shí)驗(yàn)組采用拔伸松動手法干預(yù);對照組塞來昔布膠囊經(jīng)胃灌藥干預(yù);模型組和空白組，不做治療干預(yù)。實(shí)驗(yàn)完成后，抽取實(shí)驗(yàn)兔膝關(guān)節(jié)液，黃嘌呤酶法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛（MDA）含量，ELISA法檢測過氧化脂質(zhì)（LPO）含量。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)液中SOD濃度高于對照組和模型組（P<0.05）;LPO濃度和MDA濃度均低于對照組和模型組（P<0.05）。結(jié)論 拔伸松動手法可以升高KOA模型兔關(guān)節(jié)液中SOD濃度，降低LPO和MDA濃度，增強(qiáng)機(jī)體清除氧自由基的能力，促進(jìn)損傷軟骨的修復(fù)。

關(guān)鍵詞：拔伸松動手法;關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎;SOD;LPO;MDA

中圖分類號：R684.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1007-2349（2021）03-0069-04

【Abstract】Objective： To study the effect of pulling-stretching-loosening manipulation on superoxide dismutase （SOD）， lipid peroxide （LPO） and malondialdehyde （MDA） in rabbit synovial fluid of rabbit knee osteoarthritis （KOA） model and to explore the mechanism of pulling-stretching-loosening method to promote the repair of rabbit KOA cartilage damage. Methods： 80 healthy adult rabbits were randomly divided into experimental group， control group， model group， and blank group， 20 rabbits per group. Except for the blank group， the other groups were given Videman T method to establish KOA models. The experimental group was intervened by pulling-stretching-loosening manipulation， the control group was intervened by intragastric administration of Celecoxib capsules and the model group and the blank group were not treated with therapeutic intervention. After the experiment was completed， the experimental rabbit knee joint fluid was extracted. The xanthine enzyme method was used to determine the superoxide dismutase （SOD） activity， the thiobarbituric acid method was used to detect the content of malondialdehyde （MDA）， and the ELISA method was used to detect lipid peroxide （LPO） content. Results： The concentration of SOD in the joint fluid of the experimental group was higher than that of the control group and the model group （P<0.05）. The concentration of LPO and MDA of the experiment group were lower than that of the control group and the model group （P<0.05）. Conclusion： The pulling-stretching- loosening manipulation can increase the SOD concentration in the synovial fluid of KOA model rabbits， reduce the concentration of LPO and MDA， enhance the bodys ability to scavenge oxygen free radicals and promote the repair of damaged cartilage.

【Key words】Pulling-stretching-loosening manipulation; Joint osteoarthritis; SOD; LPO; MDA

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（Knee Osteoarthritis，KOA）是一種以膝關(guān)節(jié)軟骨變性、損傷，軟骨基質(zhì)降解為早期病理特征的慢性骨關(guān)節(jié)疾病。一般認(rèn)為KOA的發(fā)病與氧自由基代謝、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子及自身免疫有關(guān)[1-3]。氧自由基代謝失衡是KOA病變的重要機(jī)制，其中超氧化物歧化酶（SOD）活性降低，丙二醛（MDA）、過氧化脂質(zhì)（LPO）含量增高，軟骨細(xì)胞凋亡加速[3]。本研究在臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上，觀察拔伸松動手法對兔KOA模型關(guān)節(jié)液中SOD、MDA、LPO含量的變化，探討拔伸松動法對兔KOA損傷軟骨修復(fù)的機(jī)制，為臨床推廣應(yīng)用提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康成年家兔80只，普通級別，單重：1.8～2.5Kg，雌雄不限，重量分布均一，均由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供。

1.2 試劑盒 兔超氧化物歧化酶ELISA檢測試劑盒、過氧化脂質(zhì)ELISA檢測試劑盒、兔丙二醛ELISA檢測試劑盒。

1.3 造模 隨機(jī)分為4組，每組10 只：實(shí)驗(yàn)組、對照組、模型組、空白組。穩(wěn)定飼養(yǎng)7 d后，采用Videman T 造模方法，管型石膏伸直位固定兔右后肢膝關(guān)節(jié)6 周，制作兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型。

1.4 實(shí)驗(yàn) 分別于造模完成后3 d開始，予各組相應(yīng)的干預(yù)措施。

1.4.1 實(shí)驗(yàn)組 給予拔伸松動手法治療干預(yù)：（1）按揉膝眼、血海、鶴頂、陽陵泉、陰陵泉、足三里、委中諸穴，30秒/穴。（2）屈伸患膝關(guān)節(jié)15次。（3）拔伸法施以患膝10秒后放松，然后在拔伸下分別以小魚際固定于膝關(guān)節(jié)下緣之內(nèi)側(cè)和外側(cè)，向?qū)?cè)推按5次（外側(cè)向內(nèi)側(cè)，內(nèi)側(cè)向外側(cè)）。（4）五指提拿髕骨10次，順時(shí)針和逆時(shí)針活動髕骨5次，再上下左右推動髕骨各10次。（5）屈伸患膝關(guān)節(jié)15次。（6）拔伸患膝10秒，在拔伸過程中作膝關(guān)節(jié)小幅度內(nèi)旋和外旋運(yùn)動。每日1次，每次10 min，連續(xù)治療20次。

1.4.2 對照組 給予塞來昔布膠囊經(jīng)胃灌藥干預(yù)，給藥量按動物與人體的每kg體重等效劑量折算系數(shù)表計(jì)算給藥劑量，大白兔劑量（mg/kg）=折算系數(shù)（W=3.3）*兔體重*人劑量（mg/kg）/人體重。將膠囊藥物粉末攪拌于溫開水中，配制成含藥量為8.8mg/mL混懸液，放入冰箱備用，每日1次，連續(xù)治療20次。

1.4.3 模型組 造模后正常飼養(yǎng)，不予干預(yù)措施，正常飼養(yǎng)20 d后取標(biāo)本。

1.4.4 空白組 不予造模，不予干預(yù)措施，正常飼養(yǎng)20 d后取標(biāo)本。

1.5 取材檢測 所有動物于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后1 d取材。耳緣靜脈注射空氣20 mL栓塞處死。取關(guān)節(jié)液：從髕上囊部位注入關(guān)節(jié)腔，注入0.9%的生理鹽水0.5 mL，反復(fù)屈伸活動膝關(guān)節(jié)后，抽出腔內(nèi)灌洗液。做好標(biāo)記后立即置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)錂z。

1.6 檢測指標(biāo) 黃嘌呤酶法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛（MDA）含量，ELISA法檢測過氧化脂質(zhì)（LPO）含量，以此作為了解自由基的反應(yīng)指標(biāo)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組數(shù)據(jù)以（x[TX-*3/8]±s）表示。組間差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA），顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組治療后家兔關(guān)節(jié)液中SOD濃度 F值=72.059，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較P=0.04<0.05顯著性差異;實(shí)驗(yàn)組與模型組比較，P=0.000<0.05有顯著性差異;實(shí)驗(yàn)組與空白組比較P=0.415>0.05無顯著差異。見表1。

2.2 4組治療后家兔關(guān)節(jié)液中LPD濃度 F值=36.099，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較P=0.05<0.05顯著性差異;實(shí)驗(yàn)組與模型組比較，P=0.000<0.05有顯著性差異;實(shí)驗(yàn)組與空白組比較P=0.952>0.05無顯著差異。見表2。

2.3 4組治療后家兔關(guān)節(jié)液中MDA濃度 F值=129.99，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較P=0.00<0.05顯著性差異;實(shí)驗(yàn)組與模型組比較，P=0.000<0.05有顯著性差異;實(shí)驗(yàn)組與空白組比較P=0.78>0.05無顯著差異。見表3。

3 討論

目前認(rèn)為KOA的發(fā)病與氧自由基代謝、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子及自身免疫有關(guān)，在力學(xué)和生物學(xué)因素共同作用下導(dǎo)致軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及軟骨下骨三者降解和合成正常偶聯(lián)失衡，病理結(jié)果為滑膜炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)軟骨損傷。研究證實(shí)：KOA患者體內(nèi)氧自由基含量增高，可能是在免疫反應(yīng)核吞噬過程中產(chǎn)生和或關(guān)節(jié)內(nèi)產(chǎn)生的細(xì)胞因子刺激軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞超常產(chǎn)生大量自由基[5]，SOD是超氧陰離子的清除劑，MDA為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，二者是檢測機(jī)體氧自由基水平的常用配對指標(biāo)。SOD活力的高低間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力，MDA含量的高低可間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，二者可作為動態(tài)評價(jià)防治KOA效果的客觀指標(biāo)。LPO是體內(nèi)細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)中的多介不飽和脂肪酸受到氧自由基的作用生成的脂質(zhì)過氧化，膜脂質(zhì)的過氧化，使膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能受損而引起多種疾病，其變化可反映組織代謝障礙，細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能損害的指標(biāo)。SOD、LPO、MDA等氧自由基代謝失衡是KOA發(fā)病的重要病理改變，SOD對細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，對氧自由基代謝保持平衡起著至關(guān)重要的作用。KOA患者體內(nèi)氧自由基含量增高，通過對軟骨基質(zhì)生理功能的改變，促使軟骨細(xì)胞退變、凋亡[3]。

推拿手法治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎已在臨床廣泛應(yīng)用，主要選用按、揉、推、拿、運(yùn)動關(guān)節(jié)等手法為主。戴七一等[6]采用揉髕手法治療實(shí)驗(yàn)性兔膝骨性關(guān)節(jié)炎，探究軟骨組織及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)揉髕手法可明顯延緩?fù)孟リP(guān)節(jié)軟骨組織的退行性改變。何偉等[7]人采用隨機(jī)對比研究松凝分筋手法治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的臨床療效，證明松凝分筋手法的特異性治療作用，療效確切且可靠。拔伸松動法包括膝關(guān)節(jié)屈伸法、拔伸下推按法、髕骨松動法、拔伸下微旋法，前期的臨床觀察證實(shí)，膝關(guān)節(jié)拔伸松動手法治療KOA療效確切[8]，動物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)拔伸松動手法可降低KOA兔膝關(guān)節(jié)液中白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的水平，改善膝骨性關(guān)節(jié)模型的關(guān)節(jié)活動度，修復(fù)退變的軟骨組織[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，兔KOA模型關(guān)節(jié)液中MDA和LPO濃度升高，對比空白組均具有顯著性差異（P<0.05），提示氧自由基濃度增高，抑制了軟骨細(xì)胞的增殖和軟骨基質(zhì)蛋白多糖及膠原的合成，加速軟骨基質(zhì)的降解，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷。而關(guān)節(jié)液中SOD降低（P<0.05），提示氧自由基清除能力降低，受損細(xì)胞修復(fù)能力下降。研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組通過拔伸松動手法治療干預(yù)后，關(guān)節(jié)液中的SOD濃度上升，LPO、MDA含量降低，與對照組（灌服塞來昔布組）和模型組比較有顯著性差異（P<0.05），說明拔伸松動法可促進(jìn)氧自由基的清除，減少氧自由基對軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損害，有利于兔KOA損傷軟骨的修復(fù)。拔伸松動法治療KOA有效，其作用機(jī)制可能為升高SOD濃度，降低LPO、MDA含量，從而改善KOA氧自由基代謝水平，提高抗氧化能力，促進(jìn)機(jī)體修復(fù)損傷的軟骨。本研究為臨床推廣應(yīng)用拔伸松動手法治療KOA提供了客觀依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]潘海東，曲波，王耶.參麥注射液對骨關(guān)節(jié)炎動物模型血液中白細(xì)胞介素1水平的影響[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志，2000.8（1）：17-18.

[2]馬建兵，沙浩渡，李向陽，等.兔實(shí)驗(yàn)性膝骨性關(guān)節(jié)炎的組織病理學(xué)及發(fā)病機(jī)理[J].中國矯形外科雜志，2001，8（1）：45.

[3]許學(xué)猛，劉文剛，方旭生，等.兔退行性膝關(guān)節(jié)病與血清中NO、SOD、MDA相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志，2003.11（4）：41-44.

[4]Panasiuk AF，Laroshuk GV，Mitrovich D.Effect of free radicals on proliferation and metabolism of chondrocytes and on sensitivity of a cellular monolayer to proteases[J].Vopr Med Khim，1995，41：19-22.

[5]Goldring SR，Goldring MB.The role of cytokines in cartilage matrix degeneration in osteoarthritis.[J].Clinical Orthopaedics And Related Reserch，2004，（427）：27-36.

[6]戴七一，文宗振，阮萍，等.揉髕手法對兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，v. 3009：1938-2145.

[7]何偉，方蘇亭，王勝利，等.松凝分筋手法治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎臨床研究[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，v.2804：752.

[8]王春林，邵長麗，向勇，等.拔伸松動法治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的臨床觀察[J].按摩與康復(fù)醫(yī)學(xué)，2011，5（2）：24-26.

[9]王春林，向勇，田啟東，等.拔伸松動法治療兔膝骨性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究.云南中醫(yī)中藥雜志，2010，31（9）：23-25.

[10]王春林，向勇，田啟東，等.“拔伸松動手法”對膝骨性關(guān)節(jié)炎兔白細(xì)胞介素1β和腫瘤壞死因子α的影響[J].環(huán)球中醫(yī)藥雜志，2014：7（2）85-88.

（收稿日期：2020-11-09）