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        五子衍宗丸對(duì)化療性腸黏膜炎小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制研究*

        2021-04-06 02:48:06周衛(wèi)東盧漢祺陳澤偉田春陽(yáng)孫曉敏趙曉山
        光明中醫(yī) 2021年5期
        關(guān)鍵詞:小鼠

        周衛(wèi)東 盧漢祺 陳澤偉 田春陽(yáng) 孫曉敏 趙曉山 譚 為

        目前對(duì)化療引起的腸黏膜炎治療手段有限,主要為止吐、抑酸、飲食干預(yù),及谷氨酰胺、益生菌等對(duì)癥治療,但其預(yù)防或者治療胃腸道黏膜炎效果有限[1-4]。

        5-HT3受體拮抗劑是臨床常用的止吐藥,有研究表明,雷莫司瓊對(duì)化療引起的胃腸道黏膜炎效果有較好的治療效果[5,6],本研究擬采用5-FU誘導(dǎo)小鼠小腸炎模型,通過(guò)五子衍宗丸(WYP)與雷莫司瓊(RAM)療效效果進(jìn)行比較,以探索WYP治療化療性腸道黏膜炎效果,并對(duì)其抗炎機(jī)制進(jìn)行初步分析,現(xiàn)報(bào)道如下。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 藥品和試劑枸杞子(寧夏,廣東健禾藥業(yè)有限公司,批號(hào):110801);鹽菟絲子(山東,廣東和翔制藥有限公司,批號(hào):111101);覆盆子(浙江,廣東三信藥業(yè)有限公司,批號(hào):110901);炒車(chē)前子(江西,廣東健禾藥業(yè)有限公司,批號(hào):110901);制五味子(產(chǎn)地:山西廣東天誠(chéng)中藥飲片有限公司,批號(hào)111002);5-FU(上海旭東海普藥業(yè)有限公司,批號(hào):FA140518);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、ELISA試劑盒 ( R&D,美國(guó));Tunel試劑盒(Roche,瑞士)等。

        1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物7周齡SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠,體質(zhì)量18~22 g(由廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXK(粵)2013-0002)。實(shí)驗(yàn)前所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,室溫22~26 ℃,相對(duì)濕度40%~60%,明暗交替12 h,自由飲水、采食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室保持安靜,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

        1.2 方法

        1.2.1 五子衍宗丸的制備五子衍宗丸混懸劑的制備方法為:將枸杞子、鹽菟絲子、覆盆子、炒車(chē)前子烘干,取枸杞子40 g,鹽菟絲子40 g,覆盆子20 g,炒車(chē)前子10 g及制五味子5 g,混合,粉碎至過(guò)120篩目的粉末,充分拌勻,分別取1.5 g,0.76 g,0.38 g粉末,加入0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)20 ml制備成懸濁液,備用[7]。

        1.2.2 分組和給藥方法小鼠隨機(jī)分為正常組、對(duì)照組、雷莫司瓊(RAM)組、五子衍宗丸高劑量(HWYP)組、五子衍宗丸中劑量(MWYP)組、五子衍宗丸低劑量(LWYP)組,每組10只。對(duì)照組、RAM組、HWYP組、MWYP組和LWYP組給予腹腔注射5-FU(mg·kg-1),第1次給藥記為給藥第0天,每天上午8:00給藥,每天1次,連續(xù)給藥5次,正常給藥相應(yīng)體積pH=7.4的PBS;HWYP組、MWYP組、LWYP組每次分別給予灌胃WYP 0.75 g·kg-1、0.38 g·kg-1、0.19 g·kg-1,RAM組給予灌胃RAM 0.1 g·kg-1,每天上午9:00給藥及下午17:00給藥各1次,從5-FU給藥前2天開(kāi)始給藥,連續(xù)7 d,正常組和對(duì)照組給予灌胃相應(yīng)體積的0.5%羧甲基纖維素鈉。

        1.3 觀察指標(biāo)

        1.3.1 體質(zhì)量情況給藥第0天開(kāi)始測(cè)量體質(zhì)量,體質(zhì)量的改變通過(guò)體質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示:體質(zhì)量分?jǐn)?shù)=第n天的體質(zhì)量×100/第0天的體質(zhì)量。

        1.3.2 腹瀉給藥第0天開(kāi)始觀察大便的情況。腹瀉癥狀評(píng)分:0分,正常;1分,微濕;2分,中等濕度;3分,松散便;4分,水樣便[4]。

        1.3.3 組織學(xué)評(píng)價(jià)麻醉小鼠,打開(kāi)腹腔,取新鮮的小鼠空腸組織,4 %多聚甲醛溶液固定24 h,行脫水、透明、浸蠟、包埋組織,病理切片用蘇木精-伊紅染色(HE),鏡下觀察。通過(guò)測(cè)量的空腸絨毛長(zhǎng)度、隱窩深度、空腸絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度比值來(lái)評(píng)價(jià)其形態(tài)學(xué)的改變。

        1.3.4 炎癥因子蛋白含量的測(cè)定將空腸組織3 g,加4℃生理鹽水,使用勻漿器勻漿后,在低溫離心機(jī) 3000 r/min 離心15 min,取上清液。含量測(cè)定方法嚴(yán)格按TNF-α、IL-6和 IL-1β試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

        1.3.5 凋亡指數(shù)分析按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作:取石蠟切片脫蠟至水、修復(fù)、破膜、加試劑1(TdT)與試劑2(dUTP)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、加試劑3、DAB顯色、復(fù)染細(xì)胞核、脫水封片。Image pro-plus 6.0軟件分析熒光tunel凋亡圖片方法:每組內(nèi)每張切片從掃描結(jié)果上在相同倍數(shù)下進(jìn)行采圖,應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)每張照片進(jìn)行分析得出每張照片陽(yáng)性細(xì)胞的比率(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))即為細(xì)胞凋亡率。

        2 結(jié)果

        2.1 小鼠體質(zhì)量變化給藥第1天起,對(duì)照組小鼠體質(zhì)量百分比相對(duì)正常組出現(xiàn)顯著下降;給藥后第3天,MWYP組體質(zhì)量百分比較對(duì)照組明顯更高(P<0.05);而到第5天,HWYP組、MWYP組、LWYP組、RAM組比對(duì)照組體質(zhì)量均明顯更高(P<0.05或P<0.01);MWYP組比LWYP組體質(zhì)量百分比明顯更高(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

        2.2 小鼠大便得分情況各5-FU模型組小鼠大便從干便、濕便,再到水樣便。注射5-FU第1天后,對(duì)照組大便得分與正常組相比得分明顯升高(P<0.01);給藥第5天,HWYP組、MWYP組、LWYP組、RAM組得分顯著低于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01),MWYP組得分顯著低于LWYP組(P<0.05)。大便得分變化見(jiàn)圖2。

        注:與正常組比較,**P<0.01;與對(duì)照組比較,#P<0.05,##P<0.01, 與LWYP組比較,圖1 五子衍宗丸對(duì)化療小鼠體質(zhì)量的影響

        注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與對(duì)照組比較,圖2 五子衍宗丸對(duì)化療小鼠腹瀉的影響

        2.3 五子衍宗丸對(duì)化療小鼠黏膜形態(tài)學(xué)的影響正常組小腸絨毛形態(tài)整齊規(guī)則,而對(duì)照組絨毛形態(tài)萎縮、缺失,損傷較嚴(yán)重。見(jiàn)圖3。與正常相比,對(duì)照組空腸絨毛高度值顯著減少、隱窩深度顯著增加、空腸絨毛高度值/隱窩深度值減少(P<0.01)。與對(duì)照組相比,HWYP組、MWYP組、LWYP組、RAM組空腸絨毛高度值顯著增加、隱窩深度值顯著減少、空腸絨毛高度值/隱窩深度比值增加(P<0.01)。MWYP組的WYP比LWYP組的WYP絨毛高度值顯著增加、隱窩深度值顯著減少、空腸絨毛高度值/隱窩深度比值增加(P<0.05或P<0.01)。與RAM組相比,HWYP組、MWYP組小鼠空腸隱窩深度更小,絨毛高度/隱窩深度比值更大(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

        注:A:正常組;B:對(duì)照組;C:RAM組;D:HWYP組;E:MWYP組;F:LWYP組(HE, ×200)圖3 各組小鼠空腸的HE染色切片圖

        2.4 五子衍宗丸對(duì)化療小鼠腸道炎癥因子的影響與正常組相比,對(duì)照組、HWYP組、MWYP組、LWYP組、RAM組小鼠空腸TNF-α、IL-1β、IL-6含量水平更高(P<0.01)。與對(duì)照組或LWYP組相比,RAM組、HWYP組、MWYP組小鼠空腸TNF-α、IL-1β、IL-6含量水平更高或含量水平更低(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)圖5。

        2.5 五子衍宗丸對(duì)化療小鼠腸道細(xì)胞凋亡的影響給藥后1 d,正常組凋亡細(xì)胞稀少,對(duì)照組可見(jiàn)大量的凋亡細(xì)胞,MWYP組較對(duì)照組凋亡細(xì)胞較少。見(jiàn)圖6。給藥后1 d(24 h)或第3天,與正常組相比,對(duì)照組、MWYP組的凋亡率顯著升高(P<0.01);與對(duì)照組比, MWYP組凋亡率顯著降低(P<0.01)。與對(duì)照組給藥第1天比較,對(duì)照組給藥第3天細(xì)胞凋亡率明顯減少。見(jiàn)圖7。

        3 討論

        化療相關(guān)性腸道黏膜炎在中醫(yī)屬于“泄瀉”“下利”范疇。腎陽(yáng)虛是中醫(yī)辨證最常見(jiàn)的證型之一[8]。腎陽(yáng)虛型泄瀉病機(jī)為陽(yáng)氣不足,命門(mén)火衰,不能助脾腐熟水谷,水谷不化而為泄瀉。五子衍宗丸為補(bǔ)腎名方,具有補(bǔ)腎益精、溫補(bǔ)腎陽(yáng)的功效。本研究通過(guò)給小鼠使用化療藥物(5-FU)的同時(shí),使用五子衍宗丸溫補(bǔ)腎陽(yáng),緩解化療藥物對(duì)腎陽(yáng)的損傷,從而證明化療過(guò)程中預(yù)防腸道黏膜炎補(bǔ)腎的重要性。

        注:與正常組比較,**P<0.01;與對(duì)照組比較,#P<0.05,##P<0.01;與RAM組比較,aP<0.05;與LWYP組比較,圖4 WYP對(duì)5-FU引起的小鼠小腸黏膜形態(tài)學(xué)的影響

        注:與PBS+蒸餾水組比較,**P<0.01;與5-FU+蒸餾水組比較,#P<0.05,##P<0.01;與LWYP組比較,圖5 WYP對(duì)炎癥因子蛋白水平的影響

        注:A:正常組;B:對(duì)照組;C:MWYP組圖6 五子衍宗丸對(duì)化療小鼠腸道細(xì)胞凋亡的影響

        注:與正常組比較,**P<0.01;與對(duì)照組比較,##P<0.05,與對(duì)照組給藥第1天比較,圖7 五子衍宗丸對(duì)化療小鼠腸道細(xì)胞凋亡的影響

        從本研究結(jié)果來(lái)看,對(duì)照組因使用5-FU后,小鼠體質(zhì)量一直出現(xiàn)顯著下降。RAM、高中劑量的WYP能顯著改善小鼠的腹瀉和體質(zhì)量下降情況,而中劑量的WYP效果明顯好于低劑量的WYP,提示W(wǎng)YP改善5-FU 引起的小鼠體質(zhì)量下降、腹瀉癥狀存在一定量效關(guān)系;在病理形態(tài)學(xué)上,對(duì)照組小鼠腸黏膜嚴(yán)重?fù)p害:絨毛形態(tài)萎縮變短、切片外觀上絨毛形態(tài)萎縮、 缺失。與對(duì)照組相比,3組WYP組、RAM組都能夠顯著性抑制5-FU引起的空腸絨毛萎縮變短、隱窩深度增加、絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度比下降,且HWYP組、MWYP組抑制隱窩深度增加的效果明顯好于RAM組,說(shuō)明WYP 能改善 5-FU對(duì)絨毛和隱窩的損害,高中劑量的WYP對(duì)隱窩細(xì)胞的保護(hù)效果明顯好于RAM。

        有研究表明:炎癥因子(如TNF-α、IL-1β)對(duì)腸道黏膜損傷的嚴(yán)重程度和修復(fù)過(guò)程起著重要的影響[9,10]。TNF-α是出現(xiàn)較早、較重要的促炎癥因子,促使其它炎癥因子(如IL-6、IL-1、IL-8等)的產(chǎn)生[7,8]。IL-6通過(guò)IL-6/STAT3信號(hào)途徑促使T細(xì)胞抗凋亡,由于T細(xì)胞對(duì)抗凋亡而累積的循環(huán)作用導(dǎo)致慢性炎癥[11]。IL-1β在化療性黏膜炎的發(fā)生也起著關(guān)鍵作用[12]。 通過(guò)對(duì)炎癥細(xì)胞因子的合成與釋放的抑制,可以減輕組織損傷,屬于機(jī)體針對(duì)化療性腸炎的一種保護(hù)作用機(jī)制[13,14]。

        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,對(duì)照組的空腸組織中 TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著性升高,提示5-FU可能通過(guò)促進(jìn) TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥細(xì)胞因子水平上升,誘導(dǎo)黏膜炎發(fā)生;而 WYP 能顯著性降低其 TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥細(xì)胞因子水平升高現(xiàn)象,說(shuō)明WYP可能通過(guò)抑制腸黏膜炎中TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥細(xì)胞因子水平發(fā)揮治療作用,其抑制作用有一定的量效關(guān)系。高、中劑量的WYP組炎癥細(xì)胞因子水平與RAM組無(wú)顯著意義,其抑制促炎抗炎因子作用與RAM相當(dāng)。因此,WYP可能抑制腸道組織中的IL-6、TNF-α、IL-1β水平,減輕炎癥反應(yīng);通過(guò)減輕炎癥反應(yīng),以保護(hù)對(duì)絨毛、隱窩的損傷,從而改善體質(zhì)量下降、腹瀉的小腸黏膜炎癥狀。

        目前認(rèn)為腸道黏膜上皮細(xì)胞凋亡在化療性腸道黏膜炎的發(fā)病中占有極其重要的地位,抑制黏膜的上皮細(xì)胞凋亡可能是控制炎癥性腸炎發(fā)生及發(fā)展的主要原因之一[15]。從本研究來(lái)看,5-FU導(dǎo)致腸道細(xì)胞加速凋亡,給藥第1天凋亡細(xì)胞數(shù)量的增加明顯超過(guò)給藥第3天,這可能說(shuō)明凋亡主要在24 h內(nèi)引發(fā),且是腸道黏膜炎發(fā)展的關(guān)鍵點(diǎn)。與對(duì)照組相比,MWYP組凋亡細(xì)胞明顯減少,說(shuō)明WYP都能夠顯著性抑制5-FU引起的細(xì)胞凋亡。因此,WYP抑制腸黏膜的細(xì)胞凋亡可能是治療化療性腸炎發(fā)生及發(fā)展的主要原因之一。

        化療對(duì)小腸細(xì)胞凋亡與促炎因子密切相關(guān)的(如TNF-α,IL-1β,IL-6)[16],有研究表明,TNF-α通過(guò)TNF-α-TNFR信號(hào)通路參與CWP通過(guò)激活FAS-caspase-8的發(fā)生和發(fā)展,從而抑制自噬而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。IL-6通過(guò)傳導(dǎo)信號(hào)誘導(dǎo)STAT3磷酸化,而STAT3自身則誘導(dǎo)抗凋亡因子bcl-xl和 bcl-2,由此誘導(dǎo)T細(xì)胞抗凋亡[18]。IL-1β可誘導(dǎo)細(xì)胞Bax等促凋亡蛋白的表達(dá),活化caspase-3、caspase-9導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生內(nèi)源性細(xì)胞凋亡[16]。

        WYP能夠抑制小鼠空腸TNF-α、IL-1β、IL-6含量水平,抑制腸道細(xì)胞的凋亡。鑒于炎癥因子與凋亡存在一定的相關(guān)性,我們推測(cè)WYP治療化療性腸炎的抗炎機(jī)制可能通過(guò)抑制TNF-α、IL-1β、IL-6水平達(dá)到抗細(xì)胞凋亡的作用,對(duì)腸道的上皮細(xì)胞凋亡的抑制進(jìn)而控制炎癥性腸炎發(fā)生及發(fā)展。盡管如此,其細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路不明,更深層次的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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