周衛(wèi)東 盧漢祺 陳澤偉 田春陽(yáng) 孫曉敏 趙曉山 譚 為

目前對(duì)化療引起的腸黏膜炎治療手段有限，主要為止吐、抑酸、飲食干預(yù)，及谷氨酰胺、益生菌等對(duì)癥治療，但其預(yù)防或者治療胃腸道黏膜炎效果有限[1-4]。

5-HT3受體拮抗劑是臨床常用的止吐藥，有研究表明，雷莫司瓊對(duì)化療引起的胃腸道黏膜炎效果有較好的治療效果[5,6]，本研究擬采用5-FU誘導(dǎo)小鼠小腸炎模型，通過(guò)五子衍宗丸(WYP)與雷莫司瓊(RAM)療效效果進(jìn)行比較，以探索WYP治療化療性腸道黏膜炎效果，并對(duì)其抗炎機(jī)制進(jìn)行初步分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑枸杞子(寧夏，廣東健禾藥業(yè)有限公司，批號(hào):110801)；鹽菟絲子(山東，廣東和翔制藥有限公司，批號(hào):111101)；覆盆子(浙江，廣東三信藥業(yè)有限公司，批號(hào):110901)；炒車(chē)前子(江西，廣東健禾藥業(yè)有限公司，批號(hào):110901)；制五味子(產(chǎn)地：山西廣東天誠(chéng)中藥飲片有限公司，批號(hào)111002)；5-FU(上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)：FA140518)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、ELISA試劑盒 ( R&D，美國(guó))；Tunel試劑盒(Roche，瑞士)等。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物7周齡SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～22 g(由廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002)。實(shí)驗(yàn)前所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，室溫22～26 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，明暗交替12 h，自由飲水、采食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室保持安靜，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 五子衍宗丸的制備五子衍宗丸混懸劑的制備方法為：將枸杞子、鹽菟絲子、覆盆子、炒車(chē)前子烘干，取枸杞子40 g，鹽菟絲子40 g，覆盆子20 g，炒車(chē)前子10 g及制五味子5 g，混合，粉碎至過(guò)120篩目的粉末，充分拌勻，分別取1.5 g，0.76 g，0.38 g粉末，加入0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)20 ml制備成懸濁液，備用[7]。

1.2.2 分組和給藥方法小鼠隨機(jī)分為正常組、對(duì)照組、雷莫司瓊(RAM)組、五子衍宗丸高劑量(HWYP)組、五子衍宗丸中劑量(MWYP)組、五子衍宗丸低劑量(LWYP)組，每組10只。對(duì)照組、RAM組、HWYP組、MWYP組和LWYP組給予腹腔注射5-FU(mg·kg-1)，第1次給藥記為給藥第0天，每天上午8:00給藥，每天1次，連續(xù)給藥5次，正常給藥相應(yīng)體積pH=7.4的PBS；HWYP組、MWYP組、LWYP組每次分別給予灌胃WYP 0.75 g·kg-1、0.38 g·kg-1、0.19 g·kg-1，RAM組給予灌胃RAM 0.1 g·kg-1，每天上午9:00給藥及下午17:00給藥各1次，從5-FU給藥前2天開(kāi)始給藥，連續(xù)7 d，正常組和對(duì)照組給予灌胃相應(yīng)體積的0.5%羧甲基纖維素鈉。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 體質(zhì)量情況給藥第0天開(kāi)始測(cè)量體質(zhì)量，體質(zhì)量的改變通過(guò)體質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示：體質(zhì)量分?jǐn)?shù)=第n天的體質(zhì)量×100/第0天的體質(zhì)量。

1.3.2 腹瀉給藥第0天開(kāi)始觀察大便的情況。腹瀉癥狀評(píng)分：0分，正常；1分，微濕；2分，中等濕度；3分，松散便；4分，水樣便[4]。

1.3.3 組織學(xué)評(píng)價(jià)麻醉小鼠，打開(kāi)腹腔，取新鮮的小鼠空腸組織，4 %多聚甲醛溶液固定24 h，行脫水、透明、浸蠟、包埋組織，病理切片用蘇木精-伊紅染色(HE)，鏡下觀察。通過(guò)測(cè)量的空腸絨毛長(zhǎng)度、隱窩深度、空腸絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度比值來(lái)評(píng)價(jià)其形態(tài)學(xué)的改變。

1.3.4 炎癥因子蛋白含量的測(cè)定將空腸組織3 g，加4℃生理鹽水，使用勻漿器勻漿后，在低溫離心機(jī) 3000 r/min 離心15 min，取上清液。含量測(cè)定方法嚴(yán)格按TNF-α、IL-6和 IL-1β試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.5 凋亡指數(shù)分析按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作：取石蠟切片脫蠟至水、修復(fù)、破膜、加試劑1(TdT)與試劑2(dUTP)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、加試劑3、DAB顯色、復(fù)染細(xì)胞核、脫水封片。Image pro-plus 6.0軟件分析熒光tunel凋亡圖片方法：每組內(nèi)每張切片從掃描結(jié)果上在相同倍數(shù)下進(jìn)行采圖，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)每張照片進(jìn)行分析得出每張照片陽(yáng)性細(xì)胞的比率(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))即為細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量變化給藥第1天起，對(duì)照組小鼠體質(zhì)量百分比相對(duì)正常組出現(xiàn)顯著下降；給藥后第3天，MWYP組體質(zhì)量百分比較對(duì)照組明顯更高(P<0.05)；而到第5天，HWYP組、MWYP組、LWYP組、RAM組比對(duì)照組體質(zhì)量均明顯更高(P<0.05或P<0.01)；MWYP組比LWYP組體質(zhì)量百分比明顯更高(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 小鼠大便得分情況各5-FU模型組小鼠大便從干便、濕便，再到水樣便。注射5-FU第1天后，對(duì)照組大便得分與正常組相比得分明顯升高(P<0.01)；給藥第5天，HWYP組、MWYP組、LWYP組、RAM組得分顯著低于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，MWYP組得分顯著低于LWYP組(P<0.05)。大便得分變化見(jiàn)圖2。

注：與正常組比較，**P<0.01；與對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01, 與LWYP組比較，圖1 五子衍宗丸對(duì)化療小鼠體質(zhì)量的影響

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與對(duì)照組比較，圖2 五子衍宗丸對(duì)化療小鼠腹瀉的影響

2.3 五子衍宗丸對(duì)化療小鼠黏膜形態(tài)學(xué)的影響正常組小腸絨毛形態(tài)整齊規(guī)則，而對(duì)照組絨毛形態(tài)萎縮、缺失，損傷較嚴(yán)重。見(jiàn)圖3。與正常相比，對(duì)照組空腸絨毛高度值顯著減少、隱窩深度顯著增加、空腸絨毛高度值/隱窩深度值減少(P<0.01)。與對(duì)照組相比，HWYP組、MWYP組、LWYP組、RAM組空腸絨毛高度值顯著增加、隱窩深度值顯著減少、空腸絨毛高度值/隱窩深度比值增加(P<0.01)。MWYP組的WYP比LWYP組的WYP絨毛高度值顯著增加、隱窩深度值顯著減少、空腸絨毛高度值/隱窩深度比值增加(P<0.05或P<0.01)。與RAM組相比，HWYP組、MWYP組小鼠空腸隱窩深度更小，絨毛高度/隱窩深度比值更大(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

注：A：正常組；B：對(duì)照組；C：RAM組；D：HWYP組；E：MWYP組；F:LWYP組(HE, ×200)圖3 各組小鼠空腸的HE染色切片圖

2.4 五子衍宗丸對(duì)化療小鼠腸道炎癥因子的影響與正常組相比，對(duì)照組、HWYP組、MWYP組、LWYP組、RAM組小鼠空腸TNF-α、IL-1β、IL-6含量水平更高(P<0.01)。與對(duì)照組或LWYP組相比，RAM組、HWYP組、MWYP組小鼠空腸TNF-α、IL-1β、IL-6含量水平更高或含量水平更低(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)圖5。

2.5 五子衍宗丸對(duì)化療小鼠腸道細(xì)胞凋亡的影響給藥后1 d，正常組凋亡細(xì)胞稀少，對(duì)照組可見(jiàn)大量的凋亡細(xì)胞，MWYP組較對(duì)照組凋亡細(xì)胞較少。見(jiàn)圖6。給藥后1 d(24 h)或第3天，與正常組相比，對(duì)照組、MWYP組的凋亡率顯著升高(P<0.01)；與對(duì)照組比， MWYP組凋亡率顯著降低(P<0.01)。與對(duì)照組給藥第1天比較，對(duì)照組給藥第3天細(xì)胞凋亡率明顯減少。見(jiàn)圖7。

3 討論

化療相關(guān)性腸道黏膜炎在中醫(yī)屬于“泄瀉”“下利”范疇。腎陽(yáng)虛是中醫(yī)辨證最常見(jiàn)的證型之一[8]。腎陽(yáng)虛型泄瀉病機(jī)為陽(yáng)氣不足，命門(mén)火衰，不能助脾腐熟水谷，水谷不化而為泄瀉。五子衍宗丸為補(bǔ)腎名方，具有補(bǔ)腎益精、溫補(bǔ)腎陽(yáng)的功效。本研究通過(guò)給小鼠使用化療藥物(5-FU)的同時(shí)，使用五子衍宗丸溫補(bǔ)腎陽(yáng)，緩解化療藥物對(duì)腎陽(yáng)的損傷，從而證明化療過(guò)程中預(yù)防腸道黏膜炎補(bǔ)腎的重要性。

注：與正常組比較，**P<0.01；與對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與RAM組比較，aP<0.05；與LWYP組比較，圖4 WYP對(duì)5-FU引起的小鼠小腸黏膜形態(tài)學(xué)的影響

注：與PBS+蒸餾水組比較，**P<0.01；與5-FU+蒸餾水組比較，#P<0.05，##P<0.01；與LWYP組比較，圖5 WYP對(duì)炎癥因子蛋白水平的影響

注：A:正常組；B:對(duì)照組；C:MWYP組圖6 五子衍宗丸對(duì)化療小鼠腸道細(xì)胞凋亡的影響

注：與正常組比較，**P<0.01；與對(duì)照組比較，##P<0.05，與對(duì)照組給藥第1天比較，圖7 五子衍宗丸對(duì)化療小鼠腸道細(xì)胞凋亡的影響

從本研究結(jié)果來(lái)看，對(duì)照組因使用5-FU后，小鼠體質(zhì)量一直出現(xiàn)顯著下降。RAM、高中劑量的WYP能顯著改善小鼠的腹瀉和體質(zhì)量下降情況，而中劑量的WYP效果明顯好于低劑量的WYP，提示W(wǎng)YP改善5-FU 引起的小鼠體質(zhì)量下降、腹瀉癥狀存在一定量效關(guān)系；在病理形態(tài)學(xué)上，對(duì)照組小鼠腸黏膜嚴(yán)重?fù)p害：絨毛形態(tài)萎縮變短、切片外觀上絨毛形態(tài)萎縮、 缺失。與對(duì)照組相比，3組WYP組、RAM組都能夠顯著性抑制5-FU引起的空腸絨毛萎縮變短、隱窩深度增加、絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度比下降，且HWYP組、MWYP組抑制隱窩深度增加的效果明顯好于RAM組，說(shuō)明WYP 能改善 5-FU對(duì)絨毛和隱窩的損害，高中劑量的WYP對(duì)隱窩細(xì)胞的保護(hù)效果明顯好于RAM。

有研究表明：炎癥因子(如TNF-α、IL-1β)對(duì)腸道黏膜損傷的嚴(yán)重程度和修復(fù)過(guò)程起著重要的影響[9,10]。TNF-α是出現(xiàn)較早、較重要的促炎癥因子，促使其它炎癥因子(如IL-6、IL-1、IL-8等)的產(chǎn)生[7,8]。IL-6通過(guò)IL-6/STAT3信號(hào)途徑促使T細(xì)胞抗凋亡，由于T細(xì)胞對(duì)抗凋亡而累積的循環(huán)作用導(dǎo)致慢性炎癥[11]。IL-1β在化療性黏膜炎的發(fā)生也起著關(guān)鍵作用[12]。 通過(guò)對(duì)炎癥細(xì)胞因子的合成與釋放的抑制，可以減輕組織損傷，屬于機(jī)體針對(duì)化療性腸炎的一種保護(hù)作用機(jī)制[13,14]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組的空腸組織中 TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著性升高，提示5-FU可能通過(guò)促進(jìn) TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥細(xì)胞因子水平上升，誘導(dǎo)黏膜炎發(fā)生；而 WYP 能顯著性降低其 TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥細(xì)胞因子水平升高現(xiàn)象，說(shuō)明WYP可能通過(guò)抑制腸黏膜炎中TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥細(xì)胞因子水平發(fā)揮治療作用，其抑制作用有一定的量效關(guān)系。高、中劑量的WYP組炎癥細(xì)胞因子水平與RAM組無(wú)顯著意義，其抑制促炎抗炎因子作用與RAM相當(dāng)。因此，WYP可能抑制腸道組織中的IL-6、TNF-α、IL-1β水平，減輕炎癥反應(yīng)；通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)，以保護(hù)對(duì)絨毛、隱窩的損傷，從而改善體質(zhì)量下降、腹瀉的小腸黏膜炎癥狀。

目前認(rèn)為腸道黏膜上皮細(xì)胞凋亡在化療性腸道黏膜炎的發(fā)病中占有極其重要的地位，抑制黏膜的上皮細(xì)胞凋亡可能是控制炎癥性腸炎發(fā)生及發(fā)展的主要原因之一[15]。從本研究來(lái)看，5-FU導(dǎo)致腸道細(xì)胞加速凋亡，給藥第1天凋亡細(xì)胞數(shù)量的增加明顯超過(guò)給藥第3天，這可能說(shuō)明凋亡主要在24 h內(nèi)引發(fā)，且是腸道黏膜炎發(fā)展的關(guān)鍵點(diǎn)。與對(duì)照組相比，MWYP組凋亡細(xì)胞明顯減少，說(shuō)明WYP都能夠顯著性抑制5-FU引起的細(xì)胞凋亡。因此，WYP抑制腸黏膜的細(xì)胞凋亡可能是治療化療性腸炎發(fā)生及發(fā)展的主要原因之一。

化療對(duì)小腸細(xì)胞凋亡與促炎因子密切相關(guān)的(如TNF-α，IL-1β，IL-6)[16]，有研究表明，TNF-α通過(guò)TNF-α-TNFR信號(hào)通路參與CWP通過(guò)激活FAS-caspase-8的發(fā)生和發(fā)展，從而抑制自噬而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。IL-6通過(guò)傳導(dǎo)信號(hào)誘導(dǎo)STAT3磷酸化，而STAT3自身則誘導(dǎo)抗凋亡因子bcl-xl和 bcl-2，由此誘導(dǎo)T細(xì)胞抗凋亡[18]。IL-1β可誘導(dǎo)細(xì)胞Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)，活化caspase-3、caspase-9導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生內(nèi)源性細(xì)胞凋亡[16]。

WYP能夠抑制小鼠空腸TNF-α、IL-1β、IL-6含量水平，抑制腸道細(xì)胞的凋亡。鑒于炎癥因子與凋亡存在一定的相關(guān)性，我們推測(cè)WYP治療化療性腸炎的抗炎機(jī)制可能通過(guò)抑制TNF-α、IL-1β、IL-6水平達(dá)到抗細(xì)胞凋亡的作用，對(duì)腸道的上皮細(xì)胞凋亡的抑制進(jìn)而控制炎癥性腸炎發(fā)生及發(fā)展。盡管如此，其細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路不明，更深層次的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。