朱澳云，朱驥文，祁洪剛，周慧，劉愛民

（安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/基因疾病與健康生物醫(yī)學(xué)安徽省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000）

在市場需求和國際競爭的拉動下，發(fā)展生物產(chǎn)業(yè)、搶占生物經(jīng)濟(jì)制高點(diǎn)已成為確保國家安全和產(chǎn)業(yè)競爭力的戰(zhàn)略重點(diǎn)［1］。微生物資源是國家的重要戰(zhàn)略生物資源，微生物產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)值不斷增長，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、林業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)境、能源等諸多領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。微生物領(lǐng)域具有巨大開發(fā)前景，當(dāng)前我國微生物資源開發(fā)應(yīng)用相較于發(fā)達(dá)國家，仍舊落后、缺少整體統(tǒng)一性。原因一是微生物的基礎(chǔ)研究落后于生產(chǎn)需求，二是對微生物基礎(chǔ)資源發(fā)掘落后。僅從農(nóng)業(yè)菌種上，美國農(nóng)業(yè)部微生物菌種中心庫目前保藏微生物種質(zhì)資源8萬株，而我國農(nóng)業(yè)菌種中心庫菌種僅為3 千多株，在數(shù)量和質(zhì)量上差距很大［2］。同時，也沒有建立全國性的信息共享平臺?；A(chǔ)工作即微生物多樣性調(diào)查及菌種提取保藏工作的落后將極大牽制應(yīng)用層面的發(fā)展［3］。

根際（Rhizosphere）是指植物根系周圍受到根系分泌物影響的區(qū)域，表現(xiàn)出的理化性質(zhì)以及生物學(xué)活性明顯不同于原土質(zhì)［4］。根際微生物直接受根系分泌物的影響，形成豐富的微生物群，被認(rèn)為是一個高度動態(tài)系統(tǒng)，且根際向周圍環(huán)境釋放各種化合物［5］，從而吸引更多的促進(jìn)植物生長的菌種。大量研究表明，根系微生物與微生物、植物間的一系列相互關(guān)系，影響植物整體健康狀況及生長發(fā)育，調(diào)控根際微生物群落結(jié)構(gòu)［6-9］。植物與根際微生物的互作現(xiàn)象及其機(jī)制，是生命科學(xué)研究關(guān)注的熱點(diǎn)，也是農(nóng)業(yè)微生物利用的關(guān)鍵問題［10］。根系微生物對植物的影響可大致分為，有益根系微生物PGPR（plant growth-promoting rhizobacteria）［11］、有害微生物 （含各類病原菌），中性微生物（共生菌）等。本研究通過研究校園觀賞樹種根際微生物的情況，探尋植物與微生物的相互作用關(guān)系，建立校園觀賞樹種根際微生物菌種資源庫，旨在建立菌種庫的同時，鑒定分離出PGPR，進(jìn)一步篩選高效產(chǎn)酶菌株，研究其與植物的互作關(guān)系。宏基因組學(xué)是專門研究直接從樣品中分離基因組DNA 后進(jìn)行測序分析，能夠準(zhǔn)確揭示微生物群落多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性及環(huán)境之間的相互協(xié)作關(guān)系，極大地豐富對土壤根系微生物種群結(jié)構(gòu)及其功能的認(rèn)識［12］。利用未開發(fā)的微生物群落鑒定和分離有效的酶是全球?qū)W術(shù)界的一個活躍領(lǐng)域，作為地球上最古老的生命類型，原核微生物具有顯著的生理、代謝和功能多樣性，并且是最豐富的遺傳多樣性資源。經(jīng)典的方法是通過培養(yǎng)微生物，再篩選所高表達(dá)酶的菌種。然而，很多環(huán)境微生物不能通過標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)培養(yǎng)，因而有大量的菌種的功能沒有得到發(fā)現(xiàn)，而宏基因組測序繞過分離、培養(yǎng)微生物的環(huán)節(jié)，直接從環(huán)境樣品中提取基因組DNA，然后對所有的微生物進(jìn)行測序。宏基因組學(xué)逐漸成為開發(fā)復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)遺傳和代謝多樣性的有力工具［13］。

校區(qū)地處北亞熱帶與中亞熱帶的交接地帶，土壤具有明顯的過渡特點(diǎn)，土壤類型復(fù)雜多樣。校區(qū)氣候總的特點(diǎn)是受東南季風(fēng)影響，溫暖濕潤，光照充足，生長季節(jié)較長，干濕季明顯。年平均氣溫在16 ℃左右，年降雨量1 300 mm，全年無霜期達(dá)240 d上下，有利于作物生長。校區(qū)土壤為普通黃棕壤，其理化性質(zhì)具有下列特點(diǎn)：表土呈酸性反應(yīng)，說明淋溶作用比較強(qiáng)烈，有機(jī)質(zhì)和全氮分別屬于低量與中等偏下；全磷含量低，全鉀含量高，代換量低。發(fā)育在砂巖上土壤質(zhì)地為重壤土，粘粒含量21.08%，發(fā)育在安山凝灰?guī)r上，質(zhì)地為輕粘土，粘粒含量36.59%［14］。

校區(qū)共有65 種植物，其中觀賞植物約41 種。研究選取校園內(nèi)日本櫻花、石楠、楓楊、銀杏、夾竹桃、紫楠六種常見植物根際土壤，對根際土壤進(jìn)行菌種分離純化、鑒定保藏；對所分離純化的菌種進(jìn)行酶活檢測，分析發(fā)現(xiàn)PGPR，篩選出高效的產(chǎn)酶菌種，初步建立校園菌種庫；并通過宏基因組檢測，對根際微生物群落構(gòu)成等進(jìn)行分析研究，探討根際微生物與植物生長的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

土樣采集于根系旁表層下處。取樣時去除表層雜物，取15 cm土層的根區(qū)土壤，每個樣品分為3份：一份立即于-20 ℃保存，用于測定根際微生物數(shù)量；一份立即帶回室內(nèi)測定土壤水分含量（烘干法）；第三份自然風(fēng)干，用于測定土壤酶活性。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

臺式高速離心機(jī)（X-22R）；瓊脂糖電泳儀（JYSPC）；土壤基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）；手提式高壓蒸汽滅菌鍋（DSX-30L）；電子天平（AR224CN）。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，瓊脂18 g，去離子水1 000 ml，pH 7.0-7.2；高氏I號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，NaCl 0.5 g，瓊脂 18 g，pH 7.2-7.4，去離子水 1 000 ml。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，去離子水1 000 ml；無菌水；鏈霉素；10%酚。

1.3 土壤微生物分離與數(shù)量統(tǒng)計(jì)

菌種分離：制備土壤懸液，對土壤懸液進(jìn)行梯度稀釋后，涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏I號培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基，根據(jù)菌種特性于28 ℃，放置2～10 d。根據(jù)菌落形態(tài)、色素、干燥等特征［15］，挑取形態(tài)差異較大的菌落進(jìn)行平板劃線再次純化并保存。

真菌采用馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，放線菌采用高氏1號培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)后采用稀釋平板法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4 基因組DNA 提取與鑒定

1.4.1 實(shí)驗(yàn)試劑

1%瓊脂糖凝膠液；5×Tris-乙酸（TAE）緩沖液：2 mol/L Tris 堿，0.5 mol/LEDTA（pH=8.0），去離子水，1 mol/L 冰乙酸；加樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)；40%（W/V）蔗糖水溶液；0.5 ug/ml 溴化乙錠；100倍電泳緩沖液：4 mol/L Tris-HCl（pH=8.0），2 mol/L醋酸鈉，200 mmol/L EDTA。

1.4.2 基因組DNA 提取

依照TIANamp Soil DNA Kit（離心柱型）所示步驟，進(jìn)行研磨、漂洗、離心、吸附等一系列處理。

1.4.3 基因組DNA 檢測

移出土壤中礫石、植物組織等，稱取250 mg 土壤，按照DNeasy R PowerSoil R Pro Kit 說明書提取微生物宏基因組DNA，NanoDrop 2 000 分光光度計(jì)測定DNA 濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA 條帶。采用PCR 擴(kuò)增基因組DNA 細(xì)菌16S rRNA V3-V4 區(qū)域。PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物鑒定合格后交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行宏基因組分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 觀賞樹種根際微生物分離

本實(shí)驗(yàn)采用的分離方法為傳統(tǒng)的菌種分離手段，利用不同的培養(yǎng)基對土壤懸液進(jìn)行菌種分析，再進(jìn)行平板劃線將單個菌落分離出來，鏡檢，再斜面保存于-20 ℃冰箱中。細(xì)菌是土壤微生物中數(shù)量最多的微生物種群，參與有機(jī)質(zhì)的分解、氨化作用等；真菌參與土壤中有機(jī)質(zhì)的分解和腐殖質(zhì)的形成，參與土壤中的氨化作用以及團(tuán)聚體的形成；土壤放線菌參與土壤有機(jī)物的分解并能分泌抗生素拮抗土壤中的病原菌。根據(jù)鏡檢結(jié)果，由表1可見，共分離出86株明顯優(yōu)勢菌種，根據(jù)每種土壤的分離結(jié)果，可以看出各個觀賞樹種中土壤菌群不同，如日本櫻花，夾竹桃和紫楠，它們的根際微生物放線菌數(shù)目種類較多。

表1 菌株分離純化種數(shù)Table 1 The species number of strains isolated

2.2 菌種豐富度

選取了日本櫻花，楓楊，石楠，夾竹桃四種觀賞樹種的根際微生物進(jìn)行了宏基因組分析，分別用1，2，3，5進(jìn)行編號，從不同角度分析菌種豐富度?；谕寥罉颖镜暮昊蚪M分類，使用DIAMOND 將基因及蛋白序列與Nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blastp同源性比對，得到功能注釋和同源物種信息，篩選條件：E-value＜1e-5，Score＞60。同時根據(jù)NCBI 的微生物分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫，獲得基因的物種分類注釋信息，并在Kingdom（界）、Phylum（門）、Class（綱）、Order（目）、Family（科）、Genus（屬）、Species（種）各個分類學(xué)水平上統(tǒng)計(jì)物種的相對豐度。根據(jù)基因?qū)用嫔蠈τ谖锓N的分類，大概有十余種不同的物種，比對以上各物種的基因數(shù)目差距也比較大，見圖1（不同顏色代表不同物種，扇形面積代表比對上該物種的基因數(shù)目）。

圖1 同源物種統(tǒng)計(jì)餅圖Fig.1 Homologous species pie chart

2.3 觀賞樹種根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

在門水平上，根據(jù)物種或功能相對豐度，將所有樣本結(jié)構(gòu)組分圖比較繪制柱狀圖。由圖2 可見，顏色對應(yīng)門分類學(xué)水平下各物種名稱，不同色塊寬度表示不同物種相對豐度比例。根據(jù)樣品中相似程序進(jìn)行排布，繪制了對應(yīng)樣本聚類樹狀圖反應(yīng)樣本中功能組分的柱狀圖。四種不同的觀賞樹種土壤根際微生物排名前八的物種，均有所不同。放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）均屬于四種樣本都大量存在的常見菌種所在的門，日本櫻花和夾竹桃土壤樣本中均占50%以上。而綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Firmicutes）、Bacteria_noname則是較多存在于5號夾竹桃的根際土壤中，1 號日本櫻花根際土壤中存在很少甚至沒有。奇古菌門（Thaumarchaeota）只存在于楓楊和石楠的根際土壤中。圖3 中左側(cè)是相似性樹狀圖，樣本間差異越小，樣本便會處在相近的同一個分支，樣本顏色按分組信息區(qū)分。右側(cè)柱狀圖，展示樣本中的物種分布，不同顏色代表不同物種。由圖2、圖3 可以看出，楓楊和石楠的土壤根際微生物比較相近，而日本櫻花的土壤根際微生物則與其它三種樣本菌種有較大的差別。這種差別主要來源于植物根系的影響，為建庫及以后研究的采樣提供了依據(jù)。

圖2 門分類水平上相對豐度柱狀圖Fig.2 Relative abundance histogram on the phylum classification level

圖3 樣品聚類樹與柱狀圖組合分析圖Fig.3 Sample cluster tree and histogram combined analysis diagram

2.4 樣本根際土壤群落的多樣性分析

為進(jìn)一步探究四種觀賞植物土壤根際微生物的區(qū)別和聯(lián)系，從物種分類水平上繼續(xù)探究。使用統(tǒng)計(jì)算法bray curtis 計(jì)算樣本間距離，距離反應(yīng)樣本間總體特征分布上的差異。然后進(jìn)行層次聚類 （Hierarchical cluatering）分析，構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)，得到樹狀關(guān)系，圖4 中樹枝的長度代表樣本間的距離，越相似的樣本會越靠近，樣本按分組以不同顏色區(qū)分。樣本編號分別為1號日本櫻花，2號楓楊，3號石楠，5 號夾竹桃。如圖4 所示，2 號楓楊和3 號石楠土壤之間的樣本距離最小，與1 號日本櫻花之間樣本距離最大，它們根際土壤菌群有明顯的差異。

圖4 物種分類水平上Hcluster 層次聚類樹Fig.4 Hcluster clustering tree on the species classification level

每個樣本都存在共有和特有的組分，本研究使用venn 圖統(tǒng)計(jì)多個樣本中共有或獨(dú)有的物種、基因或者功能成分?jǐn)?shù)目，直觀的表現(xiàn)出樣本成分組成相似性及重疊情況，重疊部分越多代表土壤樣本越相似，見圖5（不同樣本用不同顏色表示，圖中數(shù)字代表特異或共有的組分?jǐn)?shù)目）。

圖5 物種分類水平上多樣本比較Venn 圖Fig.5 The Venn diagram for multiple comparisons on the species classification level

2.5 建庫

根據(jù)每個樣本或多個樣本的分類學(xué)比對結(jié)果，選出優(yōu)勢物種的分類，從整個分類系統(tǒng)上了解樣本中優(yōu)勢微生物的進(jìn)化關(guān)系和豐度差異，如圖6所示（不同顏色代表不同的樣品，顏色的扇形面積越大，說明在該分支上該樣品的豐度越高。支點(diǎn)附近分別為該分類名稱和其對應(yīng)平均豐度數(shù)值）。根據(jù)差異和樣本的物種分類結(jié)果，將其轉(zhuǎn)化為可供參考的校園觀賞植物根際微生物資源信息庫，為以后微生物的采樣分離研究提供理論依據(jù)。

圖6 所有樣品分類學(xué)系統(tǒng)組成樹狀圖Fig.6 The taxonomic system of all samples consists of a tree diagram

2.6 碳水化合物的活性酶

碳水化合物活性酶（Carbohydrate-active enzymes,CAZymes）參與了復(fù)雜碳水化合物和糖復(fù)合物的組裝和分解［16］。本試驗(yàn)僅對微生物的碳水化合物的活性酶進(jìn)行了分析，包括能催化碳水化合物降解、修飾、以及生物合成的相關(guān)酶系家族。其包含五個主要分類：糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases,GHs）、糖基轉(zhuǎn)移酶（GlycosylTransferases,GTs）、多糖裂解酶（Polysaccharide Lyases, PLs）和糖類酯解酶（Carbohydrate Esterases, CEs）、氧化還原酶（Auxiliary Activities,AAs）。此外，還包含與碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域 （Carbohydrate-Binding Modules,CBMs）［16］。由圖7 可見（從左到右，從上到下，樣本編號分別為1號日本櫻花，2號楓楊，3號石楠，5號夾竹桃），1號日本櫻花、2 號楓楊、3 號石楠和5 號夾竹桃根際四種土壤樣品中糖苷水解酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、糖類酯解酶相關(guān)基因所占序列數(shù)較多，是大部分菌種生長所必須的基因。

3 討論與結(jié)論

圖7 碳水化合物的活性酶CAZymes 功能分類統(tǒng)計(jì)柱狀圖Fig.7 CAZymes functional Classification histogram

植物根際土壤中聚集著大量微生物，數(shù)量巨大，種類豐富，其中有有益微生物，也有病原微生物。傳統(tǒng)微生物提取技術(shù)對于菌種的分離獲取有很大的局限，能分離出的菌種數(shù)占土壤總的菌種數(shù)比例極低。細(xì)菌、真菌、放線菌是土壤中的主要微生物，但不同植物種類或品種、土壤條件和環(huán)境氣候條件會形成的特定的微生態(tài)系統(tǒng)，導(dǎo)致植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。土壤微生物對土壤健康狀況也有重大影響［17］，根際微生物同樣可以分泌一些物質(zhì)［18］，會影響根際土壤的理化性質(zhì)，同時根際環(huán)境也會影響根際微生物的定殖。根系分泌物中含有豐富的糖類、氨基酸、維生素等，能為根際微生物的生長和繁殖提供充足的碳源、氮源和其他一些營養(yǎng)元素，同時，根際分泌物也通過各種途徑影響著土壤微生物的數(shù)量、種類以及在土壤中的分布［19］。根系土壤中蘊(yùn)含著豐富的微生物資源，碳水化合物的活性酶（CAZymes）對碳水化合物代謝具有很重要作用，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。但目前人們對根系微生物的基因組、代謝、多樣性及其與植物根部之間的關(guān)系所知甚少［20］。在研究影響觀賞樹種生長因素的時候，不可忽略根際土壤微生物菌落結(jié)構(gòu)的影響。未來將在宏基因組數(shù)據(jù)的指導(dǎo)下，可以有針對性的對土壤菌種進(jìn)行進(jìn)一步的提取分離鑒定，有效率地進(jìn)行相關(guān)酶學(xué)檢測，系統(tǒng)地揭示微生物的生理代謝途徑成為可能。同時，針對樣品的微生物的群落結(jié)構(gòu)、代謝功能等特點(diǎn)，對宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步挖掘，可以更有效地尋找根系微生物中存在潛在的聯(lián)系及其與植物間的互作機(jī)制。

同為校園生境中日本櫻花、石楠、楓楊、銀杏、夾竹桃、紫楠六種植物根系土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)有明顯差異，可能不同植物的根際分泌物影響著土壤微生物的數(shù)量、菌群結(jié)構(gòu)和代謝功能。根據(jù)觀賞植物根際土壤微生物的分支及豐富度初步建立了校園菌種庫，后續(xù)可根據(jù)此進(jìn)行微生物的功能研究。不同植物根際土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)不同，為探討根際土壤微生物與植物生長關(guān)系提供了參考。