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        聚乳酸-己內(nèi)酯/纖維蛋白原納米纖維基補(bǔ)片的制備與表征

        2021-04-06 06:02:16李海迪喬燕莎何紅兵
        紡織學(xué)報(bào) 2021年1期
        關(guān)鍵詞:膜片補(bǔ)片紡絲

        楊 剛, 李海迪, 喬燕莎, 李 彥, 王 璐, 何紅兵

        (1. 東華大學(xué) 紡織學(xué)院, 上海 201620; 2. 東華大學(xué) 紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201620;3. 上海松力生物技術(shù)有限公司, 上海 201100)

        疝氣屬于普外科常見(jiàn)的疾病[1],統(tǒng)計(jì)顯示全球范圍內(nèi)的發(fā)病率為3%~5%[2],高于任何一種惡性腫瘤[3]。目前,只有通過(guò)手術(shù)才能治愈疝病,且無(wú)張力疝修補(bǔ)術(shù)是最主要的臨床治療方案[4],其修補(bǔ)原理是通過(guò)縫入疝修補(bǔ)材料,降低組織之間的牽拉,從而降低復(fù)發(fā)率。該手術(shù)恢復(fù)期短,但相應(yīng)對(duì)疝修補(bǔ)片材料的各方面性能要求也較高。

        疝修補(bǔ)片按材料可分為3類:合成補(bǔ)片、復(fù)合補(bǔ)片以及生物補(bǔ)片。合成補(bǔ)片根據(jù)其材料是否能夠被宿主機(jī)體吸收又分為可吸收補(bǔ)片和不可吸收補(bǔ)片??晌昭a(bǔ)片因植入體內(nèi)后發(fā)生降解,在力學(xué)性能的持久性上存在問(wèn)題,易導(dǎo)致疝的復(fù)發(fā)[5]。不可吸收補(bǔ)片力學(xué)性能雖穩(wěn)定可靠,但往往會(huì)導(dǎo)致異物反應(yīng)且伴隨著一系列的并發(fā)癥[6-7]。相比之下,結(jié)合不同材料優(yōu)勢(shì)的復(fù)合疝氣修補(bǔ)片改善了單一材質(zhì)補(bǔ)片存在的上述缺陷,但也面臨制備工藝過(guò)于復(fù)雜、順應(yīng)性較差等不足,限制了其在市場(chǎng)上大規(guī)模推廣與應(yīng)用。在巨大市場(chǎng)需求的推動(dòng)下,取材異體或異種的生物補(bǔ)片應(yīng)運(yùn)而生。如利用豬小腸黏膜組織制備的豬小腸黏膜下層(SIS)生物補(bǔ)片,該補(bǔ)片含多層結(jié)構(gòu),具有細(xì)胞外基質(zhì)的超高生物活性且極易被機(jī)體完全吸收[8]。該類補(bǔ)片所具有的生物相容性是其他類型補(bǔ)片無(wú)法相比的,然而有限的供體來(lái)源使得該類補(bǔ)片價(jià)格十分昂貴,且具有免疫原性風(fēng)險(xiǎn),降解過(guò)程受患者自身情況影響過(guò)大,植入機(jī)體后補(bǔ)片本身的降解與組織重建是否可達(dá)到平衡存在不確定性,最終導(dǎo)致修補(bǔ)重建失敗[9]。因此,如何完善補(bǔ)片材料的結(jié)構(gòu)與性能,為腹壁組織的再生長(zhǎng)提供良好條件,是當(dāng)前疝修補(bǔ)領(lǐng)域亟需解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

        靜電紡納米纖維膜可構(gòu)建與生物補(bǔ)片相近的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),可為細(xì)胞黏附和組織再生提供充足的空間[10-11]。聚乳酸-己內(nèi)酯(P(LLA-CL))是一種具有良好力學(xué)性能、組織相容性、生物可降解性且易加工成形性的材料,在構(gòu)建韌帶、軟骨、血管等的研究中作為組織工程支架引起了廣泛關(guān)注[12]。速溶型外科用凍干纖維蛋白膠(商品名:創(chuàng)恤封?)取材廣泛,均來(lái)自于豬血漿,含有豐富的生長(zhǎng)因子。在臨床使用中具有減少術(shù)后失血量、降低術(shù)后感染率、減少黏連、減少疤痕形成促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等特點(diǎn)[13]。

        本文擬將以P(LLA-CL)和纖維蛋白原為原料,利用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建一種生物相容性良好,且具有一定力學(xué)性能、可誘導(dǎo)組織再生的新型疝修補(bǔ)片,從而有望滿足疝修補(bǔ)領(lǐng)域的臨床需求。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

        聚乳酸-己內(nèi)酯(P(LLA-CL))聚合物(山東濟(jì)南岱罡生物科技有限公司),六氟異丙醇(上海多氟新材料科技有限公司),豬血漿中提取的纖維蛋白原(上海松力生物技術(shù)有限公司),10倍濃度杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(上海源葉生物科技有限公司),CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(同仁化學(xué)研究所,日本)。

        NEU靜電紡絲機(jī)(捷克Elmarco公司);FlexSEM1000型掃描電子顯微鏡(日本日立公司);Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Scientific公司);Escalab 250Xi 型X射線光電子能譜(美國(guó)Thermo Scientific公司);OCA15EC型水接觸角測(cè)量?jī)x(美國(guó)Dataphysics公司);CMT6104型萬(wàn)能電子試驗(yàn)機(jī)(美國(guó)Instron公司)。

        1.2 P(LLA-CL)/纖維蛋白原補(bǔ)片的制備

        用六氟異丙醇配制體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的P(LLA-CL)溶液,用六氟異丙醇/去離子水(體積比為9∶1)配制100 mg/mL的纖維蛋白原溶液。把P(LLA-CL)溶液與纖維蛋白原溶液分別按1∶0、2∶1、1∶1、1∶2、0∶1體積比進(jìn)行混合,靜電紡絲機(jī)參數(shù)設(shè)置為:電紡距離12 cm,紡絲電壓3 kV,紡絲液噴出速度1 mL/h,接收滾筒轉(zhuǎn)速300 r/min,噴頭橫移速度15 cm/min。將最終得到的靜電紡絲膜于干燥條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3 性能表征

        1.3.1 微觀形貌表征

        將5組不同比例的P(LLA-CL)/纖維蛋白原靜電紡絲膜噴金鍍膜后用掃描電鏡觀察纖維的微觀形貌。纖維直徑用圖像分析軟件Adobe Acrobat Reader測(cè)定。

        1.3.2 孔隙率測(cè)定

        將各組樣品裁剪成長(zhǎng)方形,采用稱量法,通過(guò)精確測(cè)量靜電紡絲膜的尺寸和厚度計(jì)算體積,稱量得到各自的干態(tài)質(zhì)量,最終算出靜電紡絲膜的密度和孔隙率,每組測(cè)量3個(gè)樣品并計(jì)算平均值。

        1.3.3 表面成分測(cè)定

        將5組不同比例的P(LLA-CL)/纖維蛋白原靜電紡絲膜進(jìn)行紅外和光電子能譜測(cè)試,分析對(duì)應(yīng)樣品表面化學(xué)鍵和元素類別與分布。

        1.3.4 水接觸角測(cè)試

        水接觸角可反映不同配比的P(LLA-CL)和纖維蛋白原對(duì)補(bǔ)片表面親疏水性的影響。在靜電紡絲膜樣品表面滴上約5 μL的去離子水,穩(wěn)定10 s后拍攝。每種樣品隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域測(cè)試。

        1.3.5 力學(xué)性能測(cè)試

        將各組靜電紡絲膜裁剪成長(zhǎng)為45 mm,寬為7.5 mm,最窄處2 mm的啞鈴狀,厚度精確到0.01 mm。拉伸速率為10 mm/min。每組測(cè)試5個(gè)樣品,根據(jù)應(yīng)力-應(yīng)變曲線計(jì)算各組靜電紡絲膜的斷裂強(qiáng)度、彈性模量及斷裂伸長(zhǎng)率。

        1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

        1.4.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

        為驗(yàn)證P(LLA-CL)/纖維蛋白原靜電紡絲膜對(duì)細(xì)胞有無(wú)毒性,將小鼠成纖維細(xì)胞(L929)以每孔5 000個(gè)置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,之后棄去原培養(yǎng)液,更換成P(LLA-CL)與纖維蛋白原體積比為1∶1的靜電紡絲膜浸提液100 μL進(jìn)行培養(yǎng),并設(shè)置陰性對(duì)照(0.2 mg/mL高密度聚乙烯浸提液)、陽(yáng)性對(duì)照(含5%甲基亞砜的細(xì)胞培養(yǎng)液)以及空白對(duì)照(細(xì)胞培養(yǎng)液)樣本。每2 d更換培養(yǎng)液,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以24、48、72 h為3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)培養(yǎng)后,采用CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒進(jìn)行評(píng)價(jià)。為評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性,通過(guò)下式計(jì)算相對(duì)增殖率:

        RGR=A/A0×100%

        其中:A為樣品組培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞的吸光度;A0為對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組的細(xì)胞的吸光度。

        根據(jù)RGR值按表1進(jìn)行分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定,其中毒性反應(yīng)級(jí)別在Ⅰ級(jí)以下可判斷材料合格。

        表1 細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)

        1.4.2 細(xì)胞黏附與增殖實(shí)驗(yàn)

        為探究細(xì)胞在不同比例的P(LLA-CL)/纖維蛋白原補(bǔ)片上的黏附與增殖情況,將已滅菌的各組靜電紡絲膜片置于96孔板中,并設(shè)置空白對(duì)照,重復(fù)5塊孔板。將L929以4×104個(gè)/mL細(xì)胞濃度接種于96孔板中,每孔150 μL,穩(wěn)定后置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。在4、24、72、120、168 h時(shí),仍采用CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒進(jìn)行評(píng)價(jià)。細(xì)胞黏附率Rv的計(jì)算公式為

        Rv=AXT/ABC×100%

        式中:AXT為各樣品培養(yǎng)的各時(shí)間點(diǎn)的表面黏附細(xì)胞的吸光度值;ABC為培養(yǎng)時(shí)間最長(zhǎng)的空白板表面黏附細(xì)胞的吸光度值。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 P(LLA-CL)/纖維蛋白原補(bǔ)片的形貌

        圖1示出各組復(fù)合靜電紡絲膜纖維的SEM照片。圖2示出纖維的平均直徑分布。

        圖2 纖維的直徑分布圖

        圖1顯示,各組樣品均具有連續(xù)、完整的電紡纖維網(wǎng),大量纖維無(wú)規(guī)律交叉分布,形成較為松散的結(jié)構(gòu)。純P(LLA-CL)及纖維蛋白原膜片纖維平均直徑分別為(415±83)nm及(197±53) nm,體積比為2∶1、1∶1及1∶2各組膜片的纖維平均直徑分別為(353±75) 、(331±71)、(234±66) nm。說(shuō)明通過(guò)靜電紡絲制備的復(fù)合纖維直徑分布離散較大,既有納米級(jí)纖維形成又同時(shí)分布有亞微米級(jí)纖維,且隨著纖維蛋白原比例的逐漸提高,靜電紡絲膜的纖維直徑逐漸減小。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的主要原因是纖維蛋白原改變了電紡溶液的電荷密度,使得電場(chǎng)對(duì)噴出溶液的拉伸作用增強(qiáng),導(dǎo)致靜電紡絲膜的纖維直徑隨纖維蛋白原比例的升高而減小,進(jìn)而孔隙率也隨之升高。

        2.2 孔隙率分析

        各組樣品的孔隙率如表2所示。由數(shù)據(jù)可知,各組不同比例的靜電紡絲膜樣品的孔隙率均較高,也基本符合SEM照片所觀察到的結(jié)果。通過(guò)對(duì)比數(shù)據(jù)可知,膜片的孔隙率隨著纖維蛋白原比例的增加呈增高趨勢(shì)。

        表2 不同體積比下P(LLA-CL)/纖維蛋白原靜電紡絲膜孔隙率

        2.3 成分分析

        圖3 不同樣品的紅外光譜圖

        為進(jìn)一步證實(shí)P(LLA-CL)與纖維蛋白原的成功結(jié)合,表3示出通過(guò)XPS分析的每組靜電紡絲膜的元素構(gòu)成比例情況。結(jié)果表明,P(LLA-CL)表面只有C元素和O元素,加入纖維蛋白原后,標(biāo)志著N元素和S元素的新峰出現(xiàn),并且隨著纖維蛋白原比例的提高,N、S峰值逐漸增加,進(jìn)一步表明了纖維蛋白原的成功負(fù)載。

        表3 不同體積比P(LLA-CL)/纖維蛋白原復(fù)合靜電紡絲膜各元素相對(duì)含量

        2.4 接觸角分析

        圖4、表4示出各組膜片上水接觸角的照片及數(shù)值??梢钥闯觯騊(LLA-CL)為疏水材料,其接觸角為137°±4.5°,且隨著纖維蛋白原比例的增加,接觸角逐漸變小。在純纖維蛋白原膜片上水接觸角降至最低,為19.3°±3.3°。由于纖維蛋白原的氨基酸組成中含有羧基,氨基等親水基團(tuán),進(jìn)而使得復(fù)合靜電紡絲膜的親水性提高。

        圖4 不同樣品的水接觸角圖片

        表4 不同體積比P(LLA-CL)/纖維蛋白原復(fù)合靜電紡絲膜的接觸角

        2.5 力學(xué)性能分析

        圖5示出P(LLA-CL)/纖維蛋白原復(fù)合靜電紡絲膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。表5示出通過(guò)曲線得到的各組樣品的拉伸強(qiáng)度、彈性模量及斷裂伸長(zhǎng)率。應(yīng)力-應(yīng)變曲線顯示,純P(LLA-CL)靜電紡絲膜具有較高的拉伸強(qiáng)度(8.1±0.14)MPa、斷裂伸長(zhǎng)率(190.23±15.14)%和較低的彈性模量(5.48±0.35) MPa具備彈性材料的一般特點(diǎn)??估瓘?qiáng)度高于脫細(xì)胞處理后的SIS(約7.5 MPa)。而純紡的纖維蛋白原靜電紡絲膜拉伸強(qiáng)度只有1.36 MPa,斷裂伸長(zhǎng)率為(21.34±4.23)%,表現(xiàn)出脆性的特征。P(LLA-CL)在與纖維蛋白原結(jié)合后,會(huì)發(fā)生降低斷裂伸長(zhǎng)率,增高彈性模量的力學(xué)性能變化;但拉伸強(qiáng)度表現(xiàn)尤為不同,當(dāng)體積比為2∶1及1∶1時(shí),復(fù)合膜片拉伸強(qiáng)度變化不大,但由于纖維蛋白原本身的力學(xué)性能不足,所以當(dāng)其比例增大到一定程度,即體積比達(dá)到1∶2時(shí),則可引起拉伸強(qiáng)度顯著降低。P(LLA-CL)/纖維蛋白原復(fù)合靜電紡絲膜的力學(xué)性能優(yōu)于脫細(xì)胞處理后的小腸黏膜,通過(guò)增加紡絲時(shí)間和紡絲液使用量,適當(dāng)增加補(bǔ)片的厚度,有望進(jìn)一步提升力學(xué)強(qiáng)度。

        圖5 不同比例下靜電紡絲膜應(yīng)力-應(yīng)變曲線

        表5 不同體積比P(LLA-CL)/纖維蛋白原靜電紡絲膜力學(xué)性能

        2.6 細(xì)胞毒性分析

        各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)的吸光度見(jiàn)圖6。由此測(cè)算出的相對(duì)增值率值見(jiàn)表6。P(LLA-CL)/纖維蛋白原組的L929相對(duì)增殖率均在80%以上,與陰性對(duì)照組均無(wú)明顯差異。根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),分值均在I級(jí)以下。陽(yáng)性對(duì)照組均在30%以下,評(píng)級(jí)為IV。由此可知,P(LLA-CL)/纖維蛋白靜電紡絲膜的細(xì)胞相容性良好,無(wú)細(xì)胞毒性。

        2.7 細(xì)胞黏附與增殖分析

        L929在不同基底上黏附與增殖結(jié)果見(jiàn)圖7及表7。

        圖6 不同樣品的細(xì)胞毒性

        表6 不同樣品的相對(duì)增殖率值

        圖7 L929在不同基底上的黏附細(xì)胞的吸光度值

        表7 L929細(xì)胞在不同樣品表面培養(yǎng)后的黏附率

        種植后的細(xì)胞會(huì)先后發(fā)生黏附與增殖現(xiàn)象,4 h時(shí)吸光度值基本可以反映細(xì)胞在靜電紡絲膜上的黏附數(shù)量。圖中顯示培養(yǎng)4 h后P(LLA-CL)膜片上的細(xì)胞數(shù)比其他實(shí)驗(yàn)組多,表明細(xì)胞在P(LLA-CL)黏附能力更好??瞻讓?duì)照組中的L929細(xì)胞在3 d后逐漸進(jìn)入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,與P(LLA-CL)膜片上的L929不同,黏附在P(LLA-CL)/纖維蛋白原復(fù)合膜上的L929細(xì)胞在3 d后增殖明顯變快。第7天后,體積比為2∶1的P(LLA-CL)/纖維蛋白原靜電紡絲膜組的細(xì)胞增殖速度最快,其次是體積比為1∶1、1∶2的靜電紡絲膜組,而黏附在P(LLA-CL)靜電紡絲膜上的細(xì)胞增殖速度慢。這種現(xiàn)象的發(fā)生可能和纖維蛋白原表面上與細(xì)胞黏附有關(guān)的位點(diǎn)逐漸暴露有關(guān),有報(bào)道稱纖維蛋白原的氨基基團(tuán)在細(xì)胞增殖中逐漸發(fā)揮生長(zhǎng)因子的作用[14]。Lee等[15]也證實(shí),10%的明膠濃度使復(fù)合膜具有更好的NIH-3T3細(xì)胞相容性。

        3 結(jié) 論

        1)聚乳酸-己內(nèi)酯(P(LLA-CL))與纖維蛋白原共混后進(jìn)行靜電紡絲,成功制備了高孔隙率的納米纖維膜,且證實(shí)了纖維蛋白原的存在。同時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,纖維蛋白原的加入改變了P(LLA-CL)原有的力學(xué)性能,并提高了其親水性。

        2)P(LLA-CL)/纖維蛋白原復(fù)合膜具有良好的細(xì)胞相容性,且因纖維蛋白原富含生長(zhǎng)因子,促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。

        3)通過(guò)P(LLA-CL)與纖維蛋白原復(fù)合構(gòu)建的納米纖維膜,具有潛在的誘導(dǎo)組織再生能力,有望應(yīng)用于疝修補(bǔ)領(lǐng)域中。

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