楊 剛， 李海迪， 喬燕莎， 李 彥， 王 璐， 何紅兵

(1. 東華大學(xué) 紡織學(xué)院， 上海 201620； 2. 東華大學(xué) 紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201620；3. 上海松力生物技術(shù)有限公司， 上海 201100)

疝氣屬于普外科常見的疾病[1]，統(tǒng)計(jì)顯示全球范圍內(nèi)的發(fā)病率為3%～5%[2]，高于任何一種惡性腫瘤[3]。目前，只有通過手術(shù)才能治愈疝病，且無張力疝修補(bǔ)術(shù)是最主要的臨床治療方案[4]，其修補(bǔ)原理是通過縫入疝修補(bǔ)材料，降低組織之間的牽拉，從而降低復(fù)發(fā)率。該手術(shù)恢復(fù)期短，但相應(yīng)對疝修補(bǔ)片材料的各方面性能要求也較高。

疝修補(bǔ)片按材料可分為3類：合成補(bǔ)片、復(fù)合補(bǔ)片以及生物補(bǔ)片。合成補(bǔ)片根據(jù)其材料是否能夠被宿主機(jī)體吸收又分為可吸收補(bǔ)片和不可吸收補(bǔ)片。可吸收補(bǔ)片因植入體內(nèi)后發(fā)生降解，在力學(xué)性能的持久性上存在問題，易導(dǎo)致疝的復(fù)發(fā)[5]。不可吸收補(bǔ)片力學(xué)性能雖穩(wěn)定可靠，但往往會(huì)導(dǎo)致異物反應(yīng)且伴隨著一系列的并發(fā)癥[6-7]。相比之下，結(jié)合不同材料優(yōu)勢的復(fù)合疝氣修補(bǔ)片改善了單一材質(zhì)補(bǔ)片存在的上述缺陷，但也面臨制備工藝過于復(fù)雜、順應(yīng)性較差等不足，限制了其在市場上大規(guī)模推廣與應(yīng)用。在巨大市場需求的推動(dòng)下，取材異體或異種的生物補(bǔ)片應(yīng)運(yùn)而生。如利用豬小腸黏膜組織制備的豬小腸黏膜下層(SIS)生物補(bǔ)片，該補(bǔ)片含多層結(jié)構(gòu)，具有細(xì)胞外基質(zhì)的超高生物活性且極易被機(jī)體完全吸收[8]。該類補(bǔ)片所具有的生物相容性是其他類型補(bǔ)片無法相比的，然而有限的供體來源使得該類補(bǔ)片價(jià)格十分昂貴，且具有免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，降解過程受患者自身情況影響過大，植入機(jī)體后補(bǔ)片本身的降解與組織重建是否可達(dá)到平衡存在不確定性，最終導(dǎo)致修補(bǔ)重建失敗[9]。因此，如何完善補(bǔ)片材料的結(jié)構(gòu)與性能，為腹壁組織的再生長提供良好條件，是當(dāng)前疝修補(bǔ)領(lǐng)域亟需解決的關(guān)鍵問題之一。

靜電紡納米纖維膜可構(gòu)建與生物補(bǔ)片相近的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可為細(xì)胞黏附和組織再生提供充足的空間[10-11]。聚乳酸-己內(nèi)酯(P(LLA-CL))是一種具有良好力學(xué)性能、組織相容性、生物可降解性且易加工成形性的材料，在構(gòu)建韌帶、軟骨、血管等的研究中作為組織工程支架引起了廣泛關(guān)注[12]。速溶型外科用凍干纖維蛋白膠(商品名：創(chuàng)恤封?)取材廣泛，均來自于豬血漿，含有豐富的生長因子。在臨床使用中具有減少術(shù)后失血量、降低術(shù)后感染率、減少黏連、減少疤痕形成促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等特點(diǎn)[13]。

本文擬將以P(LLA-CL)和纖維蛋白原為原料，利用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建一種生物相容性良好，且具有一定力學(xué)性能、可誘導(dǎo)組織再生的新型疝修補(bǔ)片，從而有望滿足疝修補(bǔ)領(lǐng)域的臨床需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

聚乳酸-己內(nèi)酯(P(LLA-CL))聚合物(山東濟(jì)南岱罡生物科技有限公司)，六氟異丙醇(上海多氟新材料科技有限公司)，豬血漿中提取的纖維蛋白原(上海松力生物技術(shù)有限公司)，10倍濃度杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(上海源葉生物科技有限公司)，CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(同仁化學(xué)研究所，日本)。

NEU靜電紡絲機(jī)(捷克Elmarco公司)；FlexSEM1000型掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀(美國Thermo Scientific公司)；Escalab 250Xi 型X射線光電子能譜(美國Thermo Scientific公司)；OCA15EC型水接觸角測量儀(美國Dataphysics公司)；CMT6104型萬能電子試驗(yàn)機(jī)(美國Instron公司)。

1.2 P(LLA-CL)/纖維蛋白原補(bǔ)片的制備

用六氟異丙醇配制體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的P(LLA-CL)溶液，用六氟異丙醇/去離子水(體積比為9∶1)配制100 mg/mL的纖維蛋白原溶液。把P(LLA-CL)溶液與纖維蛋白原溶液分別按1∶0、2∶1、1∶1、1∶2、0∶1體積比進(jìn)行混合，靜電紡絲機(jī)參數(shù)設(shè)置為：電紡距離12 cm，紡絲電壓3 kV，紡絲液噴出速度1 mL/h，接收滾筒轉(zhuǎn)速300 r/min，噴頭橫移速度15 cm/min。將最終得到的靜電紡絲膜于干燥條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 性能表征

1.3.1 微觀形貌表征

將5組不同比例的P(LLA-CL)/纖維蛋白原靜電紡絲膜噴金鍍膜后用掃描電鏡觀察纖維的微觀形貌。纖維直徑用圖像分析軟件Adobe Acrobat Reader測定。

1.3.2 孔隙率測定

將各組樣品裁剪成長方形，采用稱量法，通過精確測量靜電紡絲膜的尺寸和厚度計(jì)算體積，稱量得到各自的干態(tài)質(zhì)量，最終算出靜電紡絲膜的密度和孔隙率，每組測量3個(gè)樣品并計(jì)算平均值。

1.3.3 表面成分測定

將5組不同比例的P(LLA-CL)/纖維蛋白原靜電紡絲膜進(jìn)行紅外和光電子能譜測試，分析對應(yīng)樣品表面化學(xué)鍵和元素類別與分布。

1.3.4 水接觸角測試

水接觸角可反映不同配比的P(LLA-CL)和纖維蛋白原對補(bǔ)片表面親疏水性的影響。在靜電紡絲膜樣品表面滴上約5 μL的去離子水，穩(wěn)定10 s后拍攝。每種樣品隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域測試。

1.3.5 力學(xué)性能測試

將各組靜電紡絲膜裁剪成長為45 mm，寬為7.5 mm，最窄處2 mm的啞鈴狀，厚度精確到0.01 mm。拉伸速率為10 mm/min。每組測試5個(gè)樣品，根據(jù)應(yīng)力-應(yīng)變曲線計(jì)算各組靜電紡絲膜的斷裂強(qiáng)度、彈性模量及斷裂伸長率。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證P(LLA-CL)/纖維蛋白原靜電紡絲膜對細(xì)胞有無毒性，將小鼠成纖維細(xì)胞(L929)以每孔5 000個(gè)置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，之后棄去原培養(yǎng)液，更換成P(LLA-CL)與纖維蛋白原體積比為1∶1的靜電紡絲膜浸提液100 μL進(jìn)行培養(yǎng)，并設(shè)置陰性對照(0.2 mg/mL高密度聚乙烯浸提液)、陽性對照(含5%甲基亞砜的細(xì)胞培養(yǎng)液)以及空白對照(細(xì)胞培養(yǎng)液)樣本。每2 d更換培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以24、48、72 h為3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)培養(yǎng)后，采用CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒進(jìn)行評價(jià)。為評價(jià)細(xì)胞毒性，通過下式計(jì)算相對增殖率：

RGR=A/A0×100%

其中：A為樣品組培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞的吸光度；A0為對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)空白對照組的細(xì)胞的吸光度。

根據(jù)RGR值按表1進(jìn)行分級標(biāo)準(zhǔn)判定，其中毒性反應(yīng)級別在Ⅰ級以下可判斷材料合格。

表1 細(xì)胞毒性反應(yīng)分級

1.4.2 細(xì)胞黏附與增殖實(shí)驗(yàn)

為探究細(xì)胞在不同比例的P(LLA-CL)/纖維蛋白原補(bǔ)片上的黏附與增殖情況，將已滅菌的各組靜電紡絲膜片置于96孔板中，并設(shè)置空白對照，重復(fù)5塊孔板。將L929以4×104個(gè)/mL細(xì)胞濃度接種于96孔板中，每孔150 μL，穩(wěn)定后置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。在4、24、72、120、168 h時(shí)，仍采用CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒進(jìn)行評價(jià)。細(xì)胞黏附率Rv的計(jì)算公式為

Rv=AXT/ABC×100%

式中：AXT為各樣品培養(yǎng)的各時(shí)間點(diǎn)的表面黏附細(xì)胞的吸光度值；ABC為培養(yǎng)時(shí)間最長的空白板表面黏附細(xì)胞的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 P(LLA-CL)/纖維蛋白原補(bǔ)片的形貌

圖1示出各組復(fù)合靜電紡絲膜纖維的SEM照片。圖2示出纖維的平均直徑分布。

圖2 纖維的直徑分布圖

圖1顯示，各組樣品均具有連續(xù)、完整的電紡纖維網(wǎng)，大量纖維無規(guī)律交叉分布，形成較為松散的結(jié)構(gòu)。純P(LLA-CL)及纖維蛋白原膜片纖維平均直徑分別為(415±83)nm及(197±53) nm，體積比為2∶1、1∶1及1∶2各組膜片的纖維平均直徑分別為(353±75) 、(331±71)、(234±66) nm。說明通過靜電紡絲制備的復(fù)合纖維直徑分布離散較大，既有納米級纖維形成又同時(shí)分布有亞微米級纖維，且隨著纖維蛋白原比例的逐漸提高，靜電紡絲膜的纖維直徑逐漸減小。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的主要原因是纖維蛋白原改變了電紡溶液的電荷密度，使得電場對噴出溶液的拉伸作用增強(qiáng)，導(dǎo)致靜電紡絲膜的纖維直徑隨纖維蛋白原比例的升高而減小，進(jìn)而孔隙率也隨之升高。

2.2 孔隙率分析

各組樣品的孔隙率如表2所示。由數(shù)據(jù)可知，各組不同比例的靜電紡絲膜樣品的孔隙率均較高，也基本符合SEM照片所觀察到的結(jié)果。通過對比數(shù)據(jù)可知，膜片的孔隙率隨著纖維蛋白原比例的增加呈增高趨勢。

表2 不同體積比下P(LLA-CL)/纖維蛋白原靜電紡絲膜孔隙率

2.3 成分分析

圖3 不同樣品的紅外光譜圖

為進(jìn)一步證實(shí)P(LLA-CL)與纖維蛋白原的成功結(jié)合，表3示出通過XPS分析的每組靜電紡絲膜的元素構(gòu)成比例情況。結(jié)果表明，P(LLA-CL)表面只有C元素和O元素，加入纖維蛋白原后，標(biāo)志著N元素和S元素的新峰出現(xiàn)，并且隨著纖維蛋白原比例的提高，N、S峰值逐漸增加，進(jìn)一步表明了纖維蛋白原的成功負(fù)載。

表3 不同體積比P(LLA-CL)/纖維蛋白原復(fù)合靜電紡絲膜各元素相對含量

2.4 接觸角分析

圖4、表4示出各組膜片上水接觸角的照片及數(shù)值?？梢钥闯觯騊(LLA-CL)為疏水材料，其接觸角為137°±4.5°，且隨著纖維蛋白原比例的增加，接觸角逐漸變小。在純纖維蛋白原膜片上水接觸角降至最低，為19.3°±3.3°。由于纖維蛋白原的氨基酸組成中含有羧基，氨基等親水基團(tuán)，進(jìn)而使得復(fù)合靜電紡絲膜的親水性提高。

圖4 不同樣品的水接觸角圖片

表4 不同體積比P(LLA-CL)/纖維蛋白原復(fù)合靜電紡絲膜的接觸角

2.5 力學(xué)性能分析

圖5示出P(LLA-CL)/纖維蛋白原復(fù)合靜電紡絲膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。表5示出通過曲線得到的各組樣品的拉伸強(qiáng)度、彈性模量及斷裂伸長率。應(yīng)力-應(yīng)變曲線顯示，純P(LLA-CL)靜電紡絲膜具有較高的拉伸強(qiáng)度(8.1±0.14)MPa、斷裂伸長率(190.23±15.14)%和較低的彈性模量(5.48±0.35) MPa具備彈性材料的一般特點(diǎn)?？估瓘?qiáng)度高于脫細(xì)胞處理后的SIS(約7.5 MPa)。而純紡的纖維蛋白原靜電紡絲膜拉伸強(qiáng)度只有1.36 MPa，斷裂伸長率為(21.34±4.23)%，表現(xiàn)出脆性的特征。P(LLA-CL)在與纖維蛋白原結(jié)合后，會(huì)發(fā)生降低斷裂伸長率，增高彈性模量的力學(xué)性能變化;但拉伸強(qiáng)度表現(xiàn)尤為不同，當(dāng)體積比為2∶1及1∶1時(shí)，復(fù)合膜片拉伸強(qiáng)度變化不大，但由于纖維蛋白原本身的力學(xué)性能不足，所以當(dāng)其比例增大到一定程度，即體積比達(dá)到1∶2時(shí)，則可引起拉伸強(qiáng)度顯著降低。P(LLA-CL)/纖維蛋白原復(fù)合靜電紡絲膜的力學(xué)性能優(yōu)于脫細(xì)胞處理后的小腸黏膜，通過增加紡絲時(shí)間和紡絲液使用量，適當(dāng)增加補(bǔ)片的厚度，有望進(jìn)一步提升力學(xué)強(qiáng)度。

圖5 不同比例下靜電紡絲膜應(yīng)力-應(yīng)變曲線

表5 不同體積比P(LLA-CL)/纖維蛋白原靜電紡絲膜力學(xué)性能

2.6 細(xì)胞毒性分析

各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)的吸光度見圖6。由此測算出的相對增值率值見表6。P(LLA-CL)/纖維蛋白原組的L929相對增殖率均在80%以上，與陰性對照組均無明顯差異。根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)，分值均在I級以下。陽性對照組均在30%以下，評級為IV。由此可知，P(LLA-CL)/纖維蛋白靜電紡絲膜的細(xì)胞相容性良好，無細(xì)胞毒性。

2.7 細(xì)胞黏附與增殖分析

L929在不同基底上黏附與增殖結(jié)果見圖7及表7。

圖6 不同樣品的細(xì)胞毒性

表6 不同樣品的相對增殖率值

圖7 L929在不同基底上的黏附細(xì)胞的吸光度值

表7 L929細(xì)胞在不同樣品表面培養(yǎng)后的黏附率

種植后的細(xì)胞會(huì)先后發(fā)生黏附與增殖現(xiàn)象，4 h時(shí)吸光度值基本可以反映細(xì)胞在靜電紡絲膜上的黏附數(shù)量。圖中顯示培養(yǎng)4 h后P(LLA-CL)膜片上的細(xì)胞數(shù)比其他實(shí)驗(yàn)組多，表明細(xì)胞在P(LLA-CL)黏附能力更好。空白對照組中的L929細(xì)胞在3 d后逐漸進(jìn)入到對數(shù)生長期，與P(LLA-CL)膜片上的L929不同，黏附在P(LLA-CL)/纖維蛋白原復(fù)合膜上的L929細(xì)胞在3 d后增殖明顯變快。第7天后，體積比為2∶1的P(LLA-CL)/纖維蛋白原靜電紡絲膜組的細(xì)胞增殖速度最快，其次是體積比為1∶1、1∶2的靜電紡絲膜組，而黏附在P(LLA-CL)靜電紡絲膜上的細(xì)胞增殖速度慢。這種現(xiàn)象的發(fā)生可能和纖維蛋白原表面上與細(xì)胞黏附有關(guān)的位點(diǎn)逐漸暴露有關(guān)，有報(bào)道稱纖維蛋白原的氨基基團(tuán)在細(xì)胞增殖中逐漸發(fā)揮生長因子的作用[14]。Lee等[15]也證實(shí)，10%的明膠濃度使復(fù)合膜具有更好的NIH-3T3細(xì)胞相容性。

3 結(jié) 論

1)聚乳酸-己內(nèi)酯(P(LLA-CL))與纖維蛋白原共混后進(jìn)行靜電紡絲，成功制備了高孔隙率的納米纖維膜，且證實(shí)了纖維蛋白原的存在。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，纖維蛋白原的加入改變了P(LLA-CL)原有的力學(xué)性能，并提高了其親水性。

2)P(LLA-CL)/纖維蛋白原復(fù)合膜具有良好的細(xì)胞相容性，且因纖維蛋白原富含生長因子，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。

3)通過P(LLA-CL)與纖維蛋白原復(fù)合構(gòu)建的納米纖維膜，具有潛在的誘導(dǎo)組織再生能力，有望應(yīng)用于疝修補(bǔ)領(lǐng)域中。