袁久剛， 季 吉， 薛 琪， 姜 哲， 范雪榮， 高衛(wèi)東

(生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))， 江蘇 無錫 214122)

羊毛是一種利用價(jià)值極高的天然角蛋白纖維,但是只有非常少量的細(xì)羊毛能用作紡織原材料，紡織行業(yè)每年都會(huì)產(chǎn)生數(shù)以萬噸計(jì)的羊毛邊角料，這不僅造成角蛋白資源的浪費(fèi)，還給自然環(huán)境造成較大壓力。作為一種性能高、來源廣的可再生天然大分子，角蛋白具有良好的材料力學(xué)性能和生物相容性，在生物醫(yī)用材料[1]、膜材料[2]、纖維材料[3]、可降解塑料和其他功能材料方面具有廣泛應(yīng)用。若能將羊毛溶解再生得到角蛋白，其附加值將得到大幅提升。

近幾年，隨著離子液體在纖維素溶解中的廣泛應(yīng)用，該體系也逐漸引起了角蛋白研究者的關(guān)注。在纖維素溶解中，離子液體的強(qiáng)極性可有效破壞大分子之間的氫鍵作用從而實(shí)現(xiàn)高分子聚合物的溶解[4-5]。對(duì)于角蛋白而言，其溶解則更具挑戰(zhàn)性，因?yàn)榻堑鞍追肿娱g不僅含有氫鍵，而且還含有大量的二硫鍵，這在一些研究中也得到了印證。例如：謝海波等[6]首先采用咪唑離子液體實(shí)現(xiàn)了羊毛的溶解和再生，但是要想達(dá)到較高溶解率必須采用非常高的溶解溫度(130 ℃)以及較長的溶解時(shí)間(10 h)。之后，孫平等[7]研究了離子液體對(duì)雞毛的溶解和再生，研究發(fā)現(xiàn)再生雞毛角蛋白的β-折疊含量下降，同時(shí)溶解過程伴隨少量二硫鍵的破壞，但是并未進(jìn)行深入研究。本課題組研究[8]指出，這是由于高溫導(dǎo)致的二硫鍵熱裂解所致。孫艷麗等[9]采用巰基乙醇和離子液體混合體系對(duì)羊毛進(jìn)行溶解，經(jīng)過巰基乙醇還原后，離子液體的溶解效率大幅提高。這些研究都說明，只有有效破壞角蛋白的二硫鍵，離子液體在角蛋白中的溶解潛能才能得到進(jìn)一步釋放。

為此，本文選用一種新型的還原性離子液體——巰基乙酸膽堿對(duì)羊毛進(jìn)行了溶解再生。巰基乙酸膽堿可以由巰基乙酸和氯化膽堿經(jīng)簡單的中和反應(yīng)得到。本文首先采用偏光顯微鏡觀察了單根羊毛纖維、皮質(zhì)層和鱗片細(xì)胞在巰基乙酸膽堿中的溶解過程；繼而對(duì)原羊毛和再生角蛋白的結(jié)構(gòu)性能進(jìn)行了詳細(xì)分析，探究了羊毛在巰基乙酸膽堿中的溶解機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要原料與儀器

羊毛纖維，直徑約為23 μm，無錫協(xié)新毛紡織股份有限公司；巰基乙酸膽堿，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%，上海成捷離子液體有限公司。

XPV600E型電腦型偏光顯微鏡，上海比目儀器有限公司；NICOLET is10型傅里葉紅外光譜儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司； D2PHASER型X射線衍射儀，德國 Bruker 公司；Q200型差示掃描量熱儀，美國TA公司；Mini-protean Tetro Cells 電泳系統(tǒng)，美國Bio-Rad伯樂公司。

1.2 羊毛預(yù)處理

稱取適量羊毛置于索氏提取器中，用丙酮抽提脫脂，48 h后采用去離子水清洗羊毛，去除殘存的丙酮，于60 ℃烘干后將羊毛纖維剪碎備用。

1.3 羊毛角蛋白提取

準(zhǔn)確稱取一定量的脫脂羊毛，將其置于20 g巰基乙酸膽堿中，于設(shè)定溫度下磁力加熱攪拌溶解一定時(shí)間，得到黃色混合液。待混合液冷卻至室溫后，向混合液加入適量8 mol/L尿素稀釋，之后采用砂芯漏斗過濾，收集濾液后用透析袋(截留分子質(zhì)量為8 000 u)透析，直至透析液電導(dǎo)率小于4 μS/cm時(shí)，完成透析，之后離心除去不溶性沉淀，將所獲蛋白溶液冷凍干燥，得到再生角蛋白(可溶性部分)。

1.4 溶解觀察

將單根羊毛纖維、皮質(zhì)層和鱗片細(xì)胞分別置于盛有巰基乙酸膽堿的特制載玻片凹槽中，利用熱臺(tái)加熱，用數(shù)碼偏光顯微鏡觀察其溶解過程，拍照記錄。鱗片細(xì)胞及剝鱗方法參照文獻(xiàn)[10]。

1.5 化學(xué)結(jié)構(gòu)表征

使用傅里葉變換光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)表征，采用KBr壓片法分別測試原羊毛和再生羊毛角蛋白的紅外光譜。掃描范圍為4 000～600 cm-1，分辨率為0.4 cm-1，掃描次數(shù)為32。

1.6 結(jié)晶度測試

采用X射線衍射儀對(duì)樣品進(jìn)行結(jié)晶度測定，測試時(shí)取冷凍干燥后的樣品平鋪在晶片表面。測試條件：Cu靶，工作電壓為30 kV，工作電流為10 mA，掃描范圍為5°～50°，步長為0.02 (°)/min。

1.7 熱力學(xué)性能測試

采用差示掃描量熱儀對(duì)樣品進(jìn)行熱力學(xué)性能分析。分別將干燥的原羊毛和再生羊毛角蛋白放入鋁坩堝中，氮?dú)鈿夥障逻M(jìn)行測試，30 ℃下平衡5 min，測試溫度為30～280 ℃，升溫速率為10 ℃/min。

1.8 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測試

采用電泳系統(tǒng)，利用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)方法對(duì)樣品的分子質(zhì)量進(jìn)行測試，SDS-PAGE凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，標(biāo)準(zhǔn)蛋白指示劑為10～270 ku。

2 結(jié)果與討論

2.1 羊毛在巰基乙酸膽堿中的溶解速率

圖1示出在120 ℃下不同時(shí)間羊毛在巰基乙酸膽堿中溶解質(zhì)量分?jǐn)?shù)?？梢钥闯?，巰基乙酸膽堿對(duì)羊毛的溶解性能非常高，在前100 min內(nèi)，其溶解質(zhì)量分?jǐn)?shù)就能達(dá)到5%。隨溶解時(shí)間逐漸增加，溶解羊毛后的巰基乙酸膽堿體系黏度也逐漸變大，因此對(duì)羊毛的溶解速度逐漸降低，當(dāng)溶解時(shí)間為800 min時(shí)，其最高溶解質(zhì)量分?jǐn)?shù)接近16%。

2.2 溶解過程分析

圖2示出在120 ℃ 條件下整根羊毛在巰基乙酸膽堿中的溶解過程?？煽闯?，羊毛纖維在巰基乙酸膽堿中溶解時(shí)，首先發(fā)生鱗片層的溶脹(見圖2(a)～(b))，隨后是皮質(zhì)層的溶脹(見圖2(c))，進(jìn)而巰基乙酸膽堿逐漸穿透進(jìn)入羊毛內(nèi)部，纖維晶區(qū)逐漸被破壞，變得透明，偏光慢慢消失，說明皮質(zhì)層發(fā)生溶解(見圖2(d))。整個(gè)過程鱗片層和皮質(zhì)層的溶解同時(shí)發(fā)生，鱗片層首先被完全溶解，隨后皮質(zhì)層也被徹底溶解，羊毛結(jié)構(gòu)完全消失，角蛋白溶出，視野呈現(xiàn)均一的透明體系(見圖2(f))，溶解過程大約需要15 min。

圖2 羊毛纖維在巰基乙酸膽堿中溶解過程

由于羊毛的鱗片層結(jié)構(gòu)致密，富含二硫鍵，多數(shù)情況下，鱗片層對(duì)羊毛的溶解都會(huì)起到強(qiáng)烈的阻礙作用。為此，根據(jù)文獻(xiàn)[10]的方法將鱗片與皮質(zhì)層分離后分別研究鱗片層和皮質(zhì)層在巰基乙酸膽堿中的溶解過程，結(jié)果如圖3、4所示。

圖3 皮質(zhì)層在巰基乙酸膽堿中溶解過程

從圖3可看出，鱗片剝除后的羊毛皮質(zhì)層在溶解時(shí)不再發(fā)生明顯的溶脹現(xiàn)象，隨著溶解的進(jìn)行，纖維直徑逐漸變細(xì)，直至完全溶解消失。這表明巰基乙酸膽堿是皮質(zhì)層的真溶劑，整個(gè)溶解由表及里進(jìn)行，鱗片剝除后的皮質(zhì)層溶解速度更快，整個(gè)溶解過程僅需要8～10 min。

圖4 鱗片層在巰基乙酸膽堿中溶解過程

從圖4可發(fā)現(xiàn)，隨著溶解的進(jìn)行，鱗片也出現(xiàn)了逐漸變小的現(xiàn)象(見圖4(a)、(b))，溶脹不明顯。這可能是由于采用甲酸剝除鱗片時(shí)，作用時(shí)間較長，甲酸對(duì)鱗片產(chǎn)生了一定的溶脹作用，并且?guī)€基乙酸膽堿具有較強(qiáng)破壞二硫鍵的作用，導(dǎo)致鱗片結(jié)構(gòu)也能夠被快速溶解；此外，在鱗片溶解的同時(shí)，視野中出現(xiàn)了許多小氣泡(見圖4(c)～(e)中的黑點(diǎn))，直至最后鱗片完全消失時(shí)，棕褐色氣泡仍然存在。采用醋酸鉛試紙檢測時(shí)，試紙變黑，初步推測是由于二硫鍵斷裂產(chǎn)生了硫化氫氣體[11]。

綜合圖2～4可發(fā)現(xiàn)，鱗片存在時(shí)，單根羊毛纖維在溶解時(shí)存在明顯的溶脹現(xiàn)象，而當(dāng)鱗片剝除后，溶脹現(xiàn)象基本消失，皮質(zhì)層的溶解速率明顯加快，這說明鱗片對(duì)纖維的溶解起到了較強(qiáng)的阻礙作用。當(dāng)鱗片覆蓋在纖維表面的時(shí)候，部分巰基乙酸膽堿通過鱗片間隙滲透進(jìn)入皮質(zhì)層，導(dǎo)致皮質(zhì)層蛋白發(fā)生快速溶解;但是由于鱗片的溶解速度較慢，因此，在外層鱗片的束縛下，最終出現(xiàn)了溶脹現(xiàn)象。

2.3 再生角蛋白化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

圖5示出原羊毛和不同溫度下再生角蛋白的紅外光譜圖?？煽闯觯蛎堑湫偷牡鞍踪|(zhì)纖維，其紅外譜圖中有4個(gè)典型的酰胺鍵吸收峰，酰胺A帶(3 300～3 290 cm-1區(qū)域)、酰胺I帶(1 650 cm-1處)、酰胺Ⅱ帶(1 540～1 530 cm-1區(qū)域)以及酰胺Ⅲ帶(1 243～1 237 cm-1區(qū)域)[12]。不同溫度下溶解再生的角蛋白紅外譜圖與原羊毛非常相似，表明溶解過程中角蛋白的主鏈結(jié)構(gòu)得到完好地保留。此外，再生角蛋白在1 058和980 cm-1處出現(xiàn)了較強(qiáng)的特征吸收峰。該處為S—O伸縮振動(dòng)峰，這是由于溶解過程中，原羊毛中胱氨酸的二硫鍵被巰基乙酸膽堿還原形成了巰基，但是在高溫條件下巰基又被空氣中的氧氣快速氧化，最終成為半胱氨酸氧化物。

圖5 原羊毛及再生角蛋白紅外光譜圖

2.4 再生角蛋白結(jié)晶度分析

圖6為原羊毛和再生角蛋白的X射線衍射譜圖?？煽吹?，羊毛及再生角蛋白均存在2θ在9°及20°附近的特征峰，其中，2θ=9°的峰主要由α-螺旋引起，2θ=20°附近的峰則主要由β-折疊引起。與原羊毛相比，再生角蛋白在2θ=9°附近特征峰強(qiáng)度明顯下降，2θ=20°附近特征峰強(qiáng)度升高，說明溶解得到的可溶性再生角蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，β-折疊結(jié)構(gòu)增加。

圖6 羊毛及再生角蛋白的X射線衍射圖譜

為進(jìn)一步說明角蛋白結(jié)晶度隨溶解溫度的變化，采用L-SEGAL建立的方法[13]，計(jì)算原羊毛與再生角蛋白的結(jié)晶指數(shù)CI，結(jié)果見表1。計(jì)算公式為

CI=(I9-I14)/I9

式中：I9為2θ等于9°處最強(qiáng)衍射峰強(qiáng)度；I14為2θ等于14°處最小衍射峰強(qiáng)度。

表1 羊毛及再生角蛋白結(jié)晶指數(shù)

由表1可看出，相較于原羊毛，可溶性再生角蛋白結(jié)晶指數(shù)降低較多。隨著溶解溫度的增加，結(jié)晶指數(shù)逐漸下降，其原因可能是高溫條件下角蛋白大分子發(fā)生了一定程度的降解，以及一部分非可溶性大分子角蛋白在透析時(shí)被去除，從而引起結(jié)晶度下降。

2.5 再生角蛋白熱性能分析

分別對(duì)原羊毛和不同溫度下再生角蛋白進(jìn)行差示掃描量熱分析，結(jié)果如圖7所示。

圖7 再生角蛋白差示掃描量熱圖

由圖7可看出，原羊毛和再生角蛋白都有2個(gè)明顯的吸熱峰。一個(gè)是介于125～155 ℃的結(jié)合水吸熱峰；另一個(gè)是200～250 ℃附近的α-螺旋解折疊和基質(zhì)胱氨酸分解雙吸熱峰[14-18]。再生角蛋白的結(jié)合水吸熱峰后移，這是因?yàn)槿芙庠偕?，通過透析主要得到的是一些可溶性角蛋白，其親水性增加，氫鍵結(jié)合能提高所致。200～250 ℃附近的雙吸熱峰隨著溶解溫度的提高，吸熱峰面積越低，這說明羊毛在巰基乙酸膽堿溶解時(shí)，其α-螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，再生后角蛋白中的α-螺旋結(jié)構(gòu)無法恢復(fù)。

2.6 再生角蛋白的分子質(zhì)量分析

圖8示出原羊毛和再生角蛋白的電泳分析結(jié)果?？煽吹?，原羊毛角蛋白在10～160 ku 的分子質(zhì)量范圍均有分布。相較于原羊毛，再生角蛋白分子質(zhì)量發(fā)生了不同程度的降低。再生角蛋白分子質(zhì)量大部分集中在10～40 ku之間，在大于40 ku區(qū)域內(nèi)，b組條帶最深，其次是c組，d組幾乎無條帶出現(xiàn)。這說明溶解過程伴隨著角蛋白大分子的降解，同時(shí)由于一部分非可溶性大分子角蛋白在透析時(shí)被去除，導(dǎo)致產(chǎn)物的分子質(zhì)量下降。并且溶解溫度對(duì)再生角蛋白分子質(zhì)量影響較大，溫度越高，再生角蛋白分子質(zhì)量越低。

a—標(biāo)準(zhǔn)蛋白；b—再生角蛋白(110 ℃)； c—再生角蛋白(120 ℃)；d—再生角蛋白(130 ℃)；e—原羊毛。

3 結(jié) 論

巰基乙酸膽堿是羊毛的優(yōu)良溶劑，能夠高效還原二硫鍵，對(duì)阻礙溶解的致密鱗片層有較強(qiáng)的破壞作用，因此可以快速溶解羊毛纖維。經(jīng)巰基乙酸膽堿溶解再生的角蛋白保留了完整的蛋白質(zhì)大分子主鏈結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量介于10～40 ku之間，但結(jié)晶度和α-螺旋結(jié)構(gòu)含量都有所降低，長時(shí)間的高溫溶解也會(huì)導(dǎo)致蛋白大分子降解;因此在利用巰基乙酸膽堿溶解角蛋白的過程中需要嚴(yán)格控制溶解溫度和溶解時(shí)間。