陳輝 余輝

咸寧市中心醫(yī)院湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院 437000

目前，雖然維持性血液透析能顯著提高慢性腎臟?。–KD）患者的長(zhǎng)期生存率和生活質(zhì)量，但血液透析的遠(yuǎn)期并發(fā)癥尤其是心血管疾?。–VD）仍是威脅患者生命和影響其預(yù)后的重要因素［1］。研究表明，40%～70%透析患者存在明顯的冠狀動(dòng)脈疾病，而其中血管鈣化（vascular calcification，VC）是導(dǎo)致血液透析患者CVD 發(fā)生及死亡的主要原因［2］。

CKD患者VC的發(fā)生并非簡(jiǎn)單的鈣磷被動(dòng)沉積，而是一個(gè)包含平滑肌細(xì)胞（VSMCs）凋亡，向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的類(lèi)似骨形成的生理過(guò)程。細(xì)胞外的鈣和磷酸鹽濃度增加后，會(huì)導(dǎo)致VSMCs由收縮型過(guò)渡到骨軟骨細(xì)胞表型，形成一個(gè)親鈣化基質(zhì)，并釋放大量的基質(zhì)囊泡，從而為羥基磷灰石形成提供結(jié)核位點(diǎn)。這個(gè)過(guò)程中鈣化抑制因子［如基質(zhì)Gla蛋白（MGP）、焦磷酸鹽（PPi）、胎球蛋白A（Fetuin-A）等］表達(dá)下調(diào)，而鈣化促進(jìn)因子［如堿性磷酸酶（ALP）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）、核結(jié)合因子α 亞單位1（Cbfa1）等］表達(dá)上調(diào)［3］。

枸櫞酸鈉（Na3Cit）是血液透析過(guò)程中常用的抗凝劑，K?se 等［4］的體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)透析患者注射枸櫞酸鈉（Na3Cit）一段時(shí)間后，心臟瓣膜的鈣化明顯減輕，瓣膜組織內(nèi)的鈣磷水平發(fā)生降低，鈣化周?chē)哪z原纖維也明顯減少。Ou 等［5］研究發(fā)現(xiàn)Na3Cit 能夠減輕患有慢性腎功能衰竭的大鼠的VC，而Meng 等［6］發(fā)現(xiàn)作為抗凝劑的肝素對(duì)CKD 大鼠的VC的進(jìn)程沒(méi)有影響。Na3Cit 中的羧基也能通過(guò)螯合羥基磷灰石（HAp）表面的鈣離子，從而阻止HAp 進(jìn)一步生長(zhǎng)并減小晶體的厚度。雖然上述大量的研究表明Na3Cit 能夠抑制VC，但其具體的抑制機(jī)制尚不清楚。

本文使用3 mmol/L 的高磷（Pi）（相當(dāng)于晚期CKD 患者血清磷的濃度）誘導(dǎo)小鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（MOVAS）鈣化，同時(shí)加入不同濃度的Na3Cit 來(lái)研究其抗VC 效果及可能的機(jī)制，期望為降低血液透析患者后期VC發(fā)病率及治療提供新的啟示，并尋找既能抗凝又能抗VC的藥物。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器（1）材料：原代小鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（MOVAS）購(gòu)自廣州吉賽生物科技股份有限公司，DMEM 培養(yǎng)液［Hyclone，?？寺∩锘瘜W(xué)制品（北京）有限公司］，胎牛血清和胰酶（Gibco，美國(guó)Gibco 公司），青霉素、鏈霉素（北京普博生物技術(shù)有限公司），細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）（日本同仁化學(xué)研究所），茜素紅染液、BCA 蛋白定量試劑盒、堿性磷酸酶試劑盒、堿性磷酸酶染色試劑盒、Na3Cit 均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，鈣測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京中生北控生物科技股份有限公司，Trizol 試劑盒（Invitrogen 公司），Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡雙染試劑盒（美國(guó)BD 公司）；其他化學(xué)試劑均為分析純并購(gòu)自廣州化學(xué)試劑公司。細(xì)胞培養(yǎng)板［NEST，耐思生物科技（無(wú)錫）有限公司］。（2）儀器：酶標(biāo)儀（Thermo Multiskan MK3，美國(guó)），倒置熒光顯微鏡（Leica DMRA2，德國(guó)），光學(xué)顯微鏡（CKX41，OLYMPUS，日本），流式細(xì)胞儀（FACS Aria，BD，美國(guó)），熒光定量PCR 儀（ABI7500型，美國(guó)ABI公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 原代MOVAS 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液在37℃、5%CO2和飽和濕度下培養(yǎng)。細(xì)胞傳代采用胰蛋白酶消化法。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%融合后用PBS 緩沖液洗滌兩次，加入0.25%胰酶-EDTA 消化液，置37℃培養(yǎng)箱3～5 min，在倒置顯微鏡下觀察消化程度，消化適度后，加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，充分吹打分散細(xì)胞，形成單細(xì)胞懸液。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè) 把1.2 中制得的單細(xì)胞懸液按濃度為5.0×104cells/ml、100 μl/孔接種于96 孔培養(yǎng)板中孵育24 h 后，改用無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)液孵育12 h，使細(xì)胞同步化。吸除培養(yǎng)液，用PBS 洗滌細(xì)胞兩次。將試驗(yàn)?zāi)Ｐ头譃? 組：（A）對(duì)照組，只加入無(wú)血清培養(yǎng)液；（B）Na3Cit 處理組，分別加入濃度為0.5、1、2、4、8、10、16 mmol/L（用無(wú)血清培養(yǎng)液配制）的Na3Cit。每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照（抑制劑濃度為0），每孔補(bǔ)加100 μl 細(xì)胞培養(yǎng)液，孵育24 h后，每孔加入10 μl 的CCK-8 試劑，避光孵育1.5 h。用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)量吸光度（A），求得3 個(gè)復(fù)孔A 值的平均值。細(xì)胞活力%＝A（試驗(yàn)組）/A（對(duì)照組）×100%。

1.4 茜素紅鈣化染色 原代MOVAS 按濃度為1.5×104cells/well接種于24孔培養(yǎng)板；吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞兩次。試驗(yàn)?zāi)Ｐ头譃? 組：（A）正常對(duì)照組：加入含1%FBS的DMEM 培養(yǎng)液（0.9 mmol/L Pi）；（B）高磷誘導(dǎo)組：加入含1% FBS 和3 mmol/L Pi 的DMEM 培養(yǎng)液；（C）低濃度Na3Cit處理組：分別加入含1 mmol/L Na3Cit的1%FBS，3 mmol/L Pi DMEM 培養(yǎng)液；（D）高濃度Na3Cit 處理組：分別加入含4 mmol/L Na3Cit 的1%FBS，3 mmol/L Pi DMEM 培養(yǎng)液。各組細(xì)胞每隔兩天換一次液，孵育14 d。孵育14 d 后棄去上清，用PBS 沖洗3 遍，4%多聚甲醛室溫固定20～30 min，再用PBS 沖洗2 遍，茜素紅染色，37℃溫箱中孵育30 min，吸去茜素紅染料，再用PBS沖洗2遍，最后用倒置顯微鏡下觀察。

1.5 細(xì)胞鈣沉積定量檢測(cè) 采用鄰甲酚酞絡(luò)合酮法檢測(cè)細(xì)胞鈣沉積量。其原理是鈣與鄰甲酚酞絡(luò)合酮在pH為10～12 時(shí)形成紅色復(fù)合物，在575 nm 紫外光處產(chǎn)生最大吸收值，光的吸收值與鈣含量成正比。細(xì)胞種板密度和試驗(yàn)分組參照1.4 進(jìn)行。培養(yǎng)14 d 后將培養(yǎng)的細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，PBS液沖洗細(xì)胞3次，每孔板內(nèi)加入0.6 mol/L鹽酸，放置在室溫下脫鈣24 h，吸取上清液參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行鈣離子含量測(cè)定。細(xì)胞脫鈣后，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，參照BCA蛋白定量試劑盒的方法檢測(cè)蛋白的含量。通過(guò)蛋白含量來(lái)標(biāo)化鈣沉積含量。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)平滑肌特異性基因表達(dá)細(xì)胞種板密度和試驗(yàn)分組參照1.4 進(jìn)行。培養(yǎng)14 d 后棄去培養(yǎng)液，PBS液沖洗細(xì)胞3次，采用Trizol試劑并按照試劑盒的方法提取總RNA，然后用上標(biāo)III 逆轉(zhuǎn)錄試劑參照試劑盒方法反轉(zhuǎn)錄為cDNA。SM22-α引物序列由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，同時(shí)參照Liao 等［7］的方法檢測(cè)和計(jì)算SM22-α mRNA表達(dá)情況。

1.7 堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè) 細(xì)胞種板密度和試驗(yàn)分組參照1.4 進(jìn)行。培養(yǎng)14 d 后將培養(yǎng)的細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，PBS 液沖洗細(xì)胞3 次，每孔加入500 μl 0.1% Triton X-100（用PBS 配制），4℃過(guò)夜，反復(fù)吹打使細(xì)胞破碎，收集在離心管中，1 200 rpm 離心3 min，收集上清，ALP 活性通過(guò)對(duì)硝基苯酚及堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒來(lái)測(cè)定，并用總蛋白來(lái)修正［7］，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.8 ALP活性定性觀察 細(xì)胞種板密度和試驗(yàn)分組參照1.4進(jìn)行。孵育14 d后棄去上清，用PBS沖洗3遍，參照堿性磷酸酶染色試劑盒方法加入染料，室溫孵育30 min，再用PBS沖洗2遍，最后用倒置顯微鏡下觀察。

1.9 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞種板以1×105cells/ml、2 ml/孔接種于6 孔板，試驗(yàn)分組參照1.4 進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)14 d 后吸除上清液，PBS 洗滌2 次，用0.25%胰酶消化，消化適度后加入10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液終止消化。吹打細(xì)胞，使細(xì)胞懸浮，然后1 000 r/min 離心5 min，棄上清，用PBS 洗滌一次，重新離心，得到細(xì)胞沉淀。加入200 μl Binding Buffer，混勻，再加入5 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。離心，去上清。加入200 μl Binding Buffer，混勻，再加入5 μl PI，直接上機(jī)檢測(cè)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 Na3Cit 對(duì)細(xì)胞活力的影響 圖1 為采用CCK-8 法檢測(cè)的不同濃度Na3Cit 與MOVAS 細(xì)胞作用24 h 后的細(xì)胞活力變化?？梢钥闯?，Na3Cit對(duì)MOVAS具有一定的毒性，且毒性存在濃度效應(yīng)。隨著抑制劑濃度從0.5 mmol/L 逐漸增加到16 mmol/L，Na3Cit 引起的細(xì)胞的活力從98.4%減少至43.5%。由于濃度大于4 mmol/L 時(shí)，Na3Cit 對(duì)細(xì)胞有較大的毒性，因此本文后期試驗(yàn)選擇抑制劑濃度1～4 mmol/L 作為研究對(duì)象，在此濃度范圍內(nèi)，抑制劑自身毒性帶來(lái)的影響相對(duì)較小，可以反映出Na3Cit 在濃度差異較大時(shí)抗VC 的效果。

2.2 Na3Cit 抑制高磷誘導(dǎo)的MOVAS 鈣化 茜素紅能與鈣鹽螯合形成橘紅色的鈣沉積物。圖2 為高磷條件下，不同濃度Na3Cit 與MOVAS 孵育14 d 后茜素紅鈣化染色結(jié)果?？梢钥闯觯海?）對(duì)照組細(xì)胞無(wú)明顯的鈣沉積出現(xiàn)（圖2A），而高磷誘導(dǎo)組（圖2B）出現(xiàn)大量的鈣沉積；（2）與高磷誘導(dǎo)組相比，加入不同濃度Na3Cit后，MOVAS鈣化斑塊明顯減少（圖2C 和2D），說(shuō)明Na3Cit 能抑制VC，并且其抑制效果隨著濃度的增加而更加明顯。

圖1 不同濃度Na3Cit與MOVAS作用24 h后的細(xì)胞活力變化

圖2 MOVAS在高磷及不同濃度Na3Cit條件下作用14 d后經(jīng)茜素紅染色后倒置顯微鏡下觀察的細(xì)胞鈣化情況（200×）

2.3 定量檢測(cè)Na3Cit 抑制鈣化效果 圖3 為采用甲酚酞絡(luò)合酮法來(lái)檢測(cè)不同濃度Na3Cit 與細(xì)胞作用14 d 后的細(xì)胞鈣沉積量。與高磷誘導(dǎo)組相比，加入Na3Cit 的處理組中細(xì)胞鈣沉積量均有不同濃度的降低，表明它們均能抑制平滑肌細(xì)胞鈣化，且高濃度的Na3Cit 抑制效果更好，這與茜素紅染色觀察的結(jié)果（圖2）一致。

圖3 MOVAS在高磷及不同濃度Na3Cit作用14 d后的鈣沉積量

2.4 Na3Cit對(duì)SM22-α表達(dá)的影響 SM22-α作為收縮型VSMCs 的標(biāo)示物，在VSMCs 向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過(guò)程中其表達(dá)下調(diào)［7］。如圖4 所示，與正常組細(xì)胞相比，高磷誘導(dǎo)組細(xì)胞中SM22-α mRNA 表達(dá)明顯下調(diào)。而不同濃度Na3Cit 處理組中SM22-α mRNA 表達(dá)明顯高于高磷誘導(dǎo)組，說(shuō)明Na3Cit 能夠通過(guò)抑制平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化來(lái)抗鈣化。且隨著濃度增加，SM22-α mRNA 表達(dá)更強(qiáng)，表明在高磷條件下Na3Cit抑制VSMCs 向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化具有濃度依賴性。

2.5 Na3Cit抑制ALP的活性 如圖5所示，不同濃度的Na3Cit 處理組細(xì)胞中ALP 的含量均比高磷誘導(dǎo)組小，表明Na3Cit 能通過(guò)抑制平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化從而抑制鈣化，且這種抑制作用具有濃度依賴性。

圖4 MOVAS在高磷及不同濃度Na3Cit作用14 d后細(xì)胞內(nèi)SM22-α mRNA表達(dá)情況

圖5 MOVAS在高磷及不同濃度Na3Cit作用14 d后細(xì)胞內(nèi)ALP的活性

2.6 定性觀察ALP 活性 為了進(jìn)一步觀察了ALP 在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)來(lái)觀察細(xì)胞表型，采用ALP 染色試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，其結(jié)果如圖6 所示。結(jié)果表明，不同濃度的Na3Cit呈濃度依賴性方式來(lái)抑制高磷誘導(dǎo)的ALP的表達(dá)，從而抑制平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。這一結(jié)果與圖5相一致。

2.7 Na3Cit抑制高磷誘導(dǎo)的MOVAS凋亡 圖7為不同濃度的Na3Cit 與MOVAS 孵育14 d 后通過(guò)Annexin V 法檢測(cè)的細(xì)胞總凋亡率（Q2+Q3）結(jié)果。高磷誘導(dǎo)組（Pi）細(xì)胞的凋亡率（16.39%）明顯高于對(duì)照組（6.33%）（圖7B）。與高磷誘導(dǎo)組相比，Na3Cit 處理組濃度從1 mmol/L 增加到4 mmol/L，細(xì)胞凋亡率從12.73%減小10.08%，表明Na3Cit 能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)抑制鈣化，且抑制效果具有濃度依賴性。

3 討論

3.1 Na3Cit 通過(guò)抑制鈣磷的沉積從而抑制鈣化 鈣化過(guò)程中凋亡小體釋放的Ca2+離子和離子均聚集在基質(zhì)小泡膜內(nèi)或接近膜處。一旦鈣離子和磷酸鹽積累至足夠量，首先形成非晶體的無(wú)定形磷酸鈣，再轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿岚蒜}，最后形成高度難溶的羥基磷灰石（HAp）。之后，HAp 通過(guò)相同方式重復(fù)成核、結(jié)晶，并擴(kuò)大沉積區(qū)域［6］。圖2 和圖3 結(jié)果表明，不同濃度的Na3Cit 均能抑制高磷誘導(dǎo)的MOVAS 鈣化，并且高濃度的Na3Cit 抑制效果更好。大量研究表明鈣化患者服用螯合劑乙二胺四乙酸（EDTA）、枸櫞酸和N，N，N，N-四-（2-吡啶基甲基）-乙二胺（TPEN）后，其動(dòng)脈粥樣硬化斑塊明顯減少［8］。并且Hu等［9］體外實(shí)驗(yàn)表明富含羧基的蛋白質(zhì)如骨鈣素和骨橋蛋白能夠抑制羥基磷灰石晶體的形成和生長(zhǎng)。因此我們推測(cè)Na3Cit 能夠直接抑制HAp 的形成從而抑制VC，這與Villa-Bellosta 和Sorribas［10］的研究結(jié)果相一致。ALP 是成骨樣細(xì)胞形成的早期標(biāo)志物。VC 過(guò)程中，ALP 被分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中，形成局部高濃度的ALP，促使磷酸鹽升高，形成不可溶解的磷酸鹽結(jié)晶，導(dǎo)致礦化形成。ALP在正常VSMCs中的濃度較低，在鈣化的血管和心臟瓣膜組織中的濃度明顯增高。

3.2 Na3Cit能通過(guò)抑制VSMCs向成骨樣表型轉(zhuǎn)化抑制VC VSMCs 向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化在VC 過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。正常血磷條件下，VSMCs表達(dá)為收縮型平滑肌細(xì)胞，其標(biāo)志物SM22-α 等表達(dá)較多［11］。高磷條件下，VSMCs 向成骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子（如Cbfa1、ALP、SOX9 以及MSX2 等）表達(dá)上調(diào)，而VSMCs 收縮特異性基因（如SM-MHC、SM22-α 和α-SMA 等）表達(dá)下調(diào)［12］。ALP 是成骨細(xì)胞的一個(gè)功能性表型標(biāo)記物，其活性經(jīng)常被視為血管鈣化的晴雨表。上調(diào)的ALP 可降解VC 的抑制因子（如PPi），從而促進(jìn)鈣化的發(fā)展［13］。Liu 等［14］和Zavaczki 等［15］發(fā)現(xiàn)抑制VSMCs 向成骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化能減輕VC。我們發(fā)現(xiàn)不同濃度的Na3Cit 均能在高磷條件下抑制ALP 的活性（圖5），并上調(diào)SM22-α的表達(dá)（圖4），說(shuō)明Na3Cit能抑制VSMCs向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化來(lái)抗VC，但其具體的信號(hào)通路還需要進(jìn)一步研究。

3.3 Na3Cit 能通過(guò)抑制MOVAS 凋亡抑制VC 細(xì)胞凋亡出現(xiàn)在VC的起始階段，并在鈣化過(guò)程中也起著重要的作用［16］。高磷能促進(jìn)VSMCs 凋亡以及釋放具有礦化能力的基質(zhì)囊泡（MV），而MV 能下調(diào)鈣化抑制因子如基質(zhì)蛋白（MGP）的表達(dá)，活化基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2），加速?gòu)椓Φ鞍捉到猓M(jìn)而促使鈣化的形成［17］。并且MV 與細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的凋亡小體一同為鈣磷結(jié)晶在主動(dòng)脈上的沉積及向HAP 的轉(zhuǎn)化提供成核位點(diǎn)，而且凋亡小體還富含Ca2+和，凋亡性細(xì)胞死亡后比原來(lái)釋放更多的鈣，這反過(guò)來(lái)又可以驅(qū)動(dòng)進(jìn)一步凋亡，從而加速鈣化的進(jìn)程［18］。而抑制細(xì)胞凋亡能夠明顯抑制VC［19］。圖4 結(jié)果表明，不同濃度的Na3Cit 均可以明顯減少高磷誘導(dǎo)MOVSA 的凋亡，并且高濃度的Na3Cit抑制效果更好，這一結(jié)果與Ciceri 等［20］的研究相一致。

圖6 MOVAS在高磷及不同濃度Na3Cit作用14 d后細(xì)胞內(nèi)ALP表達(dá)情況（400×）

圖7 MOVAS在高磷及不同濃度Na3Cit作用14 d后經(jīng)Annexin V法定量檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率（A）；細(xì)胞凋亡率（Q2+Q3）柱狀圖（B）

不同濃度的Na3Cit 均能減少高磷誘導(dǎo)的MOVAS 細(xì)胞的鈣化，且高濃度的Na3Cit抑制效果更好。Na3Cit主要通過(guò)抑制鈣磷沉積、減小高磷條件下細(xì)胞凋亡以及抑制平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化來(lái)抑制鈣化。作為血液抗凝劑的Na3Cit 有可能在臨床中同時(shí)發(fā)揮抗VC 的作用，從而為CKD 患者VC 的防治提供理論基礎(chǔ)。由于體外鈣化模型與CKD 患者體內(nèi)鈣化有很大的差異［21］，因此Na3Cit 抗鈣化的具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入探討。

利益沖突：作者已申明文章無(wú)相關(guān)利益沖突。