周源，謝利劍，肖婷婷，徐萌，張永為，李艷萍

(上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，上海市兒童醫(yī)院，上海 200062)

DES基因編碼的結(jié)蛋白(Desmin)是一種在心臟、骨骼肌和平滑肌組織中表達(dá)的肌肉特異性中間絲蛋白[1]。Desmin與其他中間絲蛋白相互作用，形成胞漿內(nèi)網(wǎng)絡(luò)，維持細(xì)胞收縮裝置和細(xì)胞其他結(jié)構(gòu)元件之間的空間關(guān)系，并負(fù)責(zé)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基底膜的連接；Desmin負(fù)責(zé)肌節(jié)的組成、裝配和信號傳導(dǎo)等，協(xié)調(diào)機(jī)械力的傳遞，維持肌節(jié)收縮的穩(wěn)定性[2]。DES基因突變呈家族性或散發(fā)性，多為常染色體顯性或隱性遺傳[3]。目前已發(fā)現(xiàn)DES基因的各種突變類型包括點突變、插入突變、較小的缺失突變和較大的外顯子跳過缺失突變[1]。Desmin突變在1980年由Edstron首次報道[4]。DES基因突變可造成Desmin在肌細(xì)胞胞漿內(nèi)聚集，常與心臟受累和骨骼肌病變有關(guān)。超過70%的致病DES基因突變表現(xiàn)為心臟受累，可與任何形式的心肌病相關(guān)，主要表現(xiàn)為擴(kuò)張型心肌病[2，5]或限制型心肌病(dilated cardiomyopathy，RCM)[6-7]，也有肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy，HCM)[8]、心律失常性心肌病[9-10]的報道，常伴有傳導(dǎo)阻滯，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)心力衰竭和心源性猝死。在擴(kuò)張型心肌病中DES基因突變的發(fā)生率在1%～2%[11]。本研究擬對1例在我院治療并通過全外顯子測序(whole-exome sequencing，WES)提示攜帶DES基因突變并以心臟受累為主要表現(xiàn)的中國患兒進(jìn)行Sanger測序，以進(jìn)一步鑒定基因突變，對突變位點行有害性預(yù)測，并對其表型進(jìn)行相關(guān)分析。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究對象為1例中國漢族12歲的男性患兒及其家系?；純喝朐呵?個月有暴發(fā)性心肌炎、心力衰竭、心源性休克、阿斯綜合征、Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯、雙下肢靜脈血栓、肺炎、肝功能損害、多漿膜腔積液病史，并接受了永久心臟起搏器植入治療。本次因“安裝起搏器術(shù)后1個月余，隨訪發(fā)現(xiàn)多漿膜腔積液較前增多，髂外靜脈血栓較前擴(kuò)大”來我院就診，住院期間完善WES提示DES基因c.1360C>T(p.Arg454Trp)雜合突變，既往無高血壓、冠心病及糖尿病史，患兒住院接受了相關(guān)藥物治療。出院后定期門診隨訪。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集家系詳細(xì)臨床資料，包括病史采集、體格檢查、實驗室檢查、心電圖、超聲心動圖等檢查的結(jié)果。本研究經(jīng)過上海市兒童醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(倫理號2019R002-F01)，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 在人類基因組變異協(xié)會(HGVS)標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上與參考基因組NCBI Genome比對，并綜合人群頻率數(shù)據(jù)庫ExAC、千人基因組(1 000 genomes project)、致病性數(shù)據(jù)庫(ClinVar、OMIM)等進(jìn)行注釋。通過NCBI Homologene對突變位點在不同物種間進(jìn)行氨基酸序列同源性比對。使用SIFT、Polyphen2、Mutation Taster、Mutation Assessor等軟件對候選基因的致病性進(jìn)行預(yù)測，評估突變致病性。

1.2.3 Sanger測序 對患兒及其父母相關(guān)突變所在區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在NCBI網(wǎng)站下載DES基因DNA全序列(NM_001927.3，Gene ID：1674)，采用Primer5軟件設(shè)計聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物，由上海生工生物工程有限公司合成；利用PCR試劑盒(天根生化科技有限公司)擴(kuò)增。引物序列為F：5’-CTGGGCTGAAGGAAAGGTGTT-3’，R：5’-ATCTCTCTTGCCCCACTAGC-3’。PCR反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，經(jīng)過30個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物純化、利用ABI 3730XL全自動DNA測序儀上機(jī)，采用正向測序，與標(biāo)準(zhǔn)序列對比分析基因序列，以進(jìn)一步驗證突變基因。

2 結(jié)果

2.1 患兒臨床資料

患兒存在嚴(yán)重的心律失常和心肌病變，沒有骨骼肌活動障礙的表現(xiàn)?；純喝朐呵?個月出現(xiàn)暴發(fā)性心肌炎、心力衰竭、心源性休克、阿斯綜合征、Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯，在外院治療并接受了心臟起搏器植入。入我院后完善相關(guān)檢查，實驗室檢查提示：N末端腦鈉肽(BNP)9 618.19 pg/mL，肌酸激酶同工酶(CK-MB)27 IU/L，肌酸激酶(CK)184 IU/L。心電圖(圖1)提示：VVI起搏器帶動良好，可見房室逆轉(zhuǎn)。超聲心動圖(圖2)提示：雙房巨大，心包積液，左心室收縮功能減低(EF 55%)，下腔靜脈及肝靜脈增寬，房間隔缺損(0.23 cm)。胸部超聲提示：雙側(cè)胸腔少量積液。腹部超聲提示：瘀血肝，腹腔積液。腹部大血管超聲未見異常。WES結(jié)果提示篩查出1個致病基因，為DES(NM_001927.3)，患兒攜帶DES基因 c.1360C>T雜合突變?；純撼鲈汉?個月，我院門診復(fù)查超聲心動圖提示(圖2)：雙房增大，房間隔缺損(0.2 cm)，心包積液較前明顯吸收，下腔靜脈及肝靜脈增寬，左心收縮功能正常(EF 68%)。

圖1 患兒心電圖

a～e為入院時檢查；f為治療后9個月復(fù)查

2.2 致病基因鑒定

通過Sanger測序進(jìn)一步證實突變，患兒攜帶DES基因c.1360C>T雜合突變，并行家系遺傳篩查，其父母均無突變，并否認(rèn)家族心臟病史(家系遺傳圖見圖3)。該突變導(dǎo)致精氨酸突變?yōu)樯彼幔ㄟ^NCBI Homologene對DES基因454位點氨基酸的對比，發(fā)現(xiàn)該位點在不同物種之間有高度保守性(圖4)。根據(jù)OMIM數(shù)據(jù)庫、ClinVar數(shù)據(jù)庫和臨床表型分析，認(rèn)為該基因突變與患者的臨床表型有關(guān)聯(lián)。該患兒攜帶的DES基因c.1360C>T(p.R454W)突變在ExAC數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫均無人群頻率報道，ClinVar數(shù)據(jù)庫顯示既往有該突變位點報道(表1)，臨床意義為致病/可能致病。通過PolyPhen2、SIFT、Mutation Taster軟件進(jìn)行DES基因c.1360C>T(p.R454W)突變的有害性預(yù)測，結(jié)果均提示有害或致病。

注:藍(lán)色代表胞嘧啶脫氧核糖核酸(C)；綠色代表腺嘌呤脫氧核糖核酸(A)；紅色代表胸腺嘧啶脫氧核糖核酸(T)；黑色代表鳥嘌呤脫氧核糖核酸(G)；雙紅線間為突變位點，患兒父母均顯示藍(lán)色波峰(C)，患兒該位點顯示紅色主峰下出現(xiàn)藍(lán)色套峰

圖4 DES基因第454突變位點在不同物種的氨基酸同源性序列比對結(jié)果

3 討論

DES基因位于2q35染色體上，共有9個外顯子，在脊椎動物中高度保守。DES基因突變常造成肌肉病變，且具有顯著臨床異質(zhì)性。骨骼肌受累表現(xiàn)為肌肉無力，從四肢遠(yuǎn)端肌肉開始，逐漸擴(kuò)展到軀干、頸部屈肌、面部。也可出現(xiàn)腸道消化不良、假性腸梗阻等胃腸平滑肌受累癥狀，嚴(yán)重者可出現(xiàn)呼吸肌受累。患者的發(fā)病年齡和病程進(jìn)展速度差異很大，可在任何年齡出現(xiàn)癥狀，通常在30歲左右發(fā)病[12]。經(jīng)研究，心肌中的Desmin蛋白比骨骼肌更豐富，是浦肯野纖維的主要組成部分。浦肯野纖維是一種特殊的心肌傳導(dǎo)系統(tǒng)，在心臟收縮中起協(xié)調(diào)作用。超過20%的DES基因突變患者表現(xiàn)為孤立的心臟癥狀，不涉及骨骼肌[5]。Li Z等[13]用小鼠模型敲除Desmin發(fā)現(xiàn)，DES-/-小鼠沒有影響發(fā)育，但成年小鼠的骨骼肌、平滑肌、心肌出現(xiàn)無組織、腫脹、纖維紊亂的不同形態(tài)異常及功能缺陷，說明Desmin對肌肉的分化并非必需，但對組織完整性的維持與增強(qiáng)必不可少。Desmin缺失造成的肌肉結(jié)構(gòu)破壞，包括肌原纖維橫向排列的丟失、肌原纖維錨定對肌膜的擾動、線粒體數(shù)量和組織的異常、細(xì)胞核形狀和位置的丟失，最終導(dǎo)致涉及心臟、骨骼和平滑肌的多系統(tǒng)疾病[3]。

表1 DES基因c.1360C>T(p.R454W)突變報道情況及臨床表現(xiàn)

Desmin蛋白的分子結(jié)構(gòu)由三部分組成，包括一個α螺旋卷曲桿域的中央?yún)^(qū)和兩側(cè)非螺旋的氨基頭端和羧基尾端，中央桿區(qū)(1A、1B、2A、2B)被3個短多肽打斷[17]。經(jīng)研究，2B區(qū)域的突變可能在Desmin二聚體之間的螺旋內(nèi)和螺旋間的離子橋上產(chǎn)生一個關(guān)鍵的斷裂，因改變了Desmin二聚體和低聚體組裝及其與膜蛋白的連接而致病，也是報道突變最多的區(qū)域[9]。1A區(qū)域突變不影響纖維網(wǎng)絡(luò)的形成，但可造成功能障礙。1B區(qū)域突變較為罕見[2]。非螺旋尾區(qū)缺乏七肽重復(fù)模式，主要參與Desmin與其他細(xì)胞骨架蛋白的相互作用，建立胞質(zhì)中間絲網(wǎng)絡(luò)[9]。大部分尾部區(qū)域的突變看似沒有破壞細(xì)胞骨架結(jié)蛋白網(wǎng)絡(luò)的形成，但足以造成功能障礙[11]。頭部和尾部區(qū)突變主要發(fā)生在孤立的心臟病表型患者中[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)1例位于DES基因尾部區(qū)域突變的患者，表現(xiàn)出嚴(yán)重的心臟表型。本例患兒在住院期間通過WES檢查發(fā)現(xiàn)攜帶DES基因c.1360C>T(p.Arg454Trp)雜合突變。該位點位于DES基因尾部的8號外顯子上。為證實該突變，進(jìn)一步行Sanger測序，證實了DES基因第1 360位的胞嘧啶突變?yōu)樾叵汆奏?，?dǎo)致第454位的精氨酸(Arg，R)被色氨酸(Trp，W)取代。通過對患兒父母的遺傳篩查均未發(fā)現(xiàn)檢測出突變基因，故本例患兒為新發(fā)變異，屬散發(fā)性病例。這也不能夠排除后天環(huán)境因素的影響。通過氨基酸同源性序列比對發(fā)現(xiàn)，DES基因的第454位氨基酸殘基在不同物種間存在高度保守性。查詢ExAC數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫均無人群頻率報道，說明該突變罕見。ClinVar數(shù)據(jù)庫顯示既往有該位點突變報道，突變意義為致病或可能致病。經(jīng)過PolyPhen2、SIFT、Mutation Taster等軟件預(yù)測顯示該位點突變很可能是有害變異，說明c.1360C>T突變很可能會影響DES基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的功能。本例患兒主要表現(xiàn)為雙心房巨大、心包積液、左心室收縮功能減低(EF 55%)，既往心電圖提示存在Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯，并接受了永久起搏器植入。實驗室檢查提示該患兒 CK-MB 輕度升高，CK屬正常范圍，因目前暫未出現(xiàn)活動障礙、骨骼肌異常和遠(yuǎn)端肌力改變等表現(xiàn)，故住院期間未進(jìn)行肌肉活檢、肌電圖檢查。因患兒存在心功能異常，BNP異常升高，同時因存在多漿膜腔積液、雙下肢靜脈血栓形成和支氣管肺炎，在住院期間予美羅培南抗感染、磷酸肌酸鈉聯(lián)合輔酶Q10營養(yǎng)心肌、復(fù)方甘草酸苷(美能)護(hù)肝、呋塞米聯(lián)合螺內(nèi)酯利尿、阿司匹林抗血小板聚集等對癥綜合治療，并完善基因檢測。經(jīng)過治療，患兒病情可，無不適后予出院。出院后繼續(xù)抗凝、利尿、保心、保肝等對癥治療，定期門診隨訪及復(fù)查，9個月后復(fù)查心臟B超提示心包積液明顯減少，左心收縮功能已達(dá)正常。

既往已有DES基因c.1360C>T(p.Arg454Trp)突變的相關(guān)病例報道與機(jī)制研究。2007年，DESp.R454W突變首次在1例因肥厚型心肌病(HCM)而出現(xiàn)運動不耐受和呼吸急促的15歲男性患者身上被發(fā)現(xiàn)，該患者同時攜帶了條件致病性的Tilin p.Q74K基因突變，最后接受了心臟移植。通過體外組裝方案發(fā)現(xiàn)，當(dāng)突變體與野生型DESmin蛋白共配時，形成的混合纖維存在固有的不親和性[14]。Otten E等[10]在以房室傳導(dǎo)阻滯(atrioven-tricular block，AVB)為主要表現(xiàn)的嚴(yán)重雙心室心肌病、不伴有骨骼肌表現(xiàn)的一對兄妹及其父親身上也發(fā)現(xiàn)了DESp.R454W突變，均在20歲左右接受了心臟起搏器植入，但因進(jìn)行性的呼吸困難和心力衰竭，患者均在30歲前后出現(xiàn)死亡。Vattemi G等[15]對21例肌原纖維性肌病的患者進(jìn)行臨床、形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)其中17例出現(xiàn)肌無力表現(xiàn)，接受心臟評估的10例患者中，7例出現(xiàn)了心臟表型異常。經(jīng)基因診斷發(fā)現(xiàn)，其中有一對兄弟分別攜帶DES基因p.S7F和p.R454W突變。B?r H等[18]進(jìn)行震蕩剪切試驗和高頻擠壓流測量研究發(fā)現(xiàn)，R454W突變不同于尾部其他位點突變，R454W不能形成正常大小的纖維網(wǎng)絡(luò)，而尾部其他突變體(如T442I、K449T、S460I、I451M)與野生型Desmin相比，纖維網(wǎng)絡(luò)大小和纖維硬度值在相同范圍，只是在纖維應(yīng)變張力上出現(xiàn)了明顯降低，造成非仿射網(wǎng)絡(luò)形變，表明DES基因尾部突變影響纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)和纖維間相互吸引作用，對纖維應(yīng)變張力產(chǎn)生影響。近年，Weihl C C等[16]在一家系中發(fā)現(xiàn)，DESp.R454W位點突變，先證者表現(xiàn)為四肢遠(yuǎn)端肌力減弱，心臟射血分?jǐn)?shù)減低(EF 40%)，雙房肥大和傳導(dǎo)阻滯。通過對患者肌肉組織活檢發(fā)現(xiàn)Desmin的內(nèi)含物與自噬空泡病理相同，提出Desmin蛋白的集聚可能激活了自噬系統(tǒng)，自噬功能及功能障礙可能是造成其發(fā)病的重要介質(zhì)，也可能是一個治療靶點。此外，Brodehl A等[5]在一家系中發(fā)現(xiàn)，攜帶DESp.L136P突變的先證者有心臟表型，該突變所致的臨床表現(xiàn)也未累及骨骼肌，并提出這可能是由于受損的骨骼肌中存在衛(wèi)星細(xì)胞，幫助了骨骼肌的更新修復(fù)，而哺乳動物心臟組織再生能力較低，以及心肌細(xì)胞與骨骼肌細(xì)胞間的結(jié)構(gòu)差異，故導(dǎo)致DES突變對心肌和骨骼肌產(chǎn)生了不同程度的影響。JurcuR O等[19]報道了1例攜帶DESc.1297C>A p.(Pro433Thr)突變的25歲女性患者，臨床特征為伴有輕度骨骼肌病變的嚴(yán)重限制型心肌病。該突變位點在基因中的位置與本研究位點相近，都屬于DES基因尾部突變?；颊邚?0歲起有反復(fù)暈厥病史，先后出現(xiàn)Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯、限制型心肌病(RCM)的心臟受累表現(xiàn)，接受了起搏器治療，在初次出現(xiàn)心臟表型的5年后才出現(xiàn)輕度肌無力的骨骼肌受累，五年間檢測指標(biāo)發(fā)現(xiàn)肌酸激酶(CK)輕度進(jìn)行性升高。

結(jié)合本例和既往相關(guān)報道可見，DESc.1360C>T(p.R454W)突變造成的心臟表型存在臨床異質(zhì)性，表型通常較嚴(yán)重，發(fā)病年齡較早，心臟不良事件發(fā)生率高，預(yù)后差，部分病例可不伴有骨骼肌的受累。在既往報道中，DESp.R454W突變多為家族遺傳。本例否認(rèn)相關(guān)家族史，其父母通過WES未檢測出攜帶相同突變，因此出現(xiàn)了偶發(fā)性突變。且本例患兒發(fā)病年齡為12歲，早于既往已報道的病例。

DES基因突變可導(dǎo)致AVB，大多數(shù)出現(xiàn)AVB的患者同時合并臨床表現(xiàn)明顯的肌病，但也有僅表現(xiàn)為RCM、AVB但無周圍肌損害癥狀的DES突變患者的病例報道，但Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯也可能是疾病的最初表現(xiàn)[20-21]。本例患兒存在Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯，在外院接受起搏器植入前確診過暴發(fā)性心肌炎，故存在暴發(fā)性心肌炎加重了DES基因突變所致AVB及其他心肌病變程度的可能，目前暫無DES基因突變與暴發(fā)性心肌炎的相關(guān)研究報道。此外，該患兒僅出現(xiàn)心肌受累表現(xiàn)，可能處于疾病進(jìn)展的初期，心臟表型先于肌病出現(xiàn)的可能性不能排除。在經(jīng)過保心、利尿、抗凝等對癥治療后，復(fù)查心臟彩超提示心包積液吸收明顯，左心收縮功能達(dá)到正常，但雙心房的擴(kuò)張并沒有顯著改善，可能存在心肌重構(gòu)，已造成不可逆的損害。至于將來是否會出現(xiàn)病情進(jìn)展或伴有骨骼肌病變，還需長期隨訪觀察，定期監(jiān)測BNP、CK、CK-MB等指標(biāo)變化。

總之，DES基因突變所致的疾病以表型各異的心肌病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)之一。當(dāng)存在嚴(yán)重心律失常、心肌病表現(xiàn)時，應(yīng)建議患者完善基因檢測，明確病因、遺傳方式及遺傳因素，有助于早期干預(yù)和治療，延緩疾病進(jìn)展，同時對相關(guān)家系成員進(jìn)行早期篩查，告知注意相關(guān)疾病的預(yù)防，對突變攜帶者起到預(yù)警作用，定期檢查以早期識別疾病，也可給予家族遺傳咨詢，做到風(fēng)險規(guī)避。