王敏，李鵬飛，李亞琪，馬全濤，王敬康，張馳，邱敏懿，張彩娟，顏期植，王停，趙保勝

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029；2.香港保和堂制藥有限公司，香港 999077；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院，北京 100029)

感冒一年四季均可發(fā)生，但以冬春季節(jié)為多[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為感冒為多種病原體引發(fā)的急性上呼吸道感染，可引發(fā)鼻、咽、喉、扁桃體等黏膜充血水腫，上皮細(xì)胞破壞、漿液、黏液及膿液滲出產(chǎn)生鼻塞、咳嗽等上呼吸道炎性癥狀，并有頭痛、惡寒發(fā)熱等全身癥狀，主要病原體為病毒，其中鼻病毒占30%～40%，冠狀病毒占10%～15%[2]。針對普通感冒病毒，當(dāng)前尚無特效藥，臨床一致認(rèn)為普通感冒對癥治療即可，無需服用抗微生物藥物。兒童由于呼吸系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟，更容易受到病毒侵襲，為感冒高發(fā)群體。臨床上治療感冒的藥品種類繁多，主要是成人型感冒藥，兒童專用型感冒藥相對匱乏，但由于兒童身體機(jī)能與成人區(qū)別較大，不宜將成人型感冒藥直接用于兒童。市售兒童感冒藥主要為化學(xué)藥物，不合理使用極易引發(fā)嚴(yán)重后果[3]。這些兒童感冒藥主要為減充血劑、抗組胺藥、解熱鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)咳藥、祛痰藥等，而復(fù)方制劑通常為上述兩類或幾類藥物合用，不良反應(yīng)較多，使用不當(dāng)會對兒童機(jī)體造成較大的損傷[4-5]。

中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為感冒多為外感六淫、時疫所致。風(fēng)邪為六淫之首，流于四時之中，與不同季節(jié)之邪氣相合傷人，臨床可見風(fēng)熱、風(fēng)寒、暑濕等證。小兒體性純陽，外感風(fēng)邪，易入里化熱，熱多于寒，風(fēng)寒證也易寒從熱化，或熱為寒閉，故小兒外感以熱證多見。風(fēng)邪傷人，先從口鼻而入，肺為華蓋，首當(dāng)其沖，感冒病位在肺衛(wèi)，肺主皮毛，其宣發(fā)之功使皮毛得以溫潤，皮毛受病，肺失宣發(fā)，則為感冒。又因小兒肺臟嬌嫩，不耐邪擾，肺氣失宣，肅降無權(quán)，水失通調(diào)，聚濕成痰，痰阻氣道。脾為后天之本，主運(yùn)化水谷，小兒脾常不足，飲食不知自節(jié)，感邪之后，肺病及脾，脾失健運(yùn)，乳食停滯，積而不化，阻滯中焦。故小兒感冒初起以發(fā)熱、惡寒、鼻塞、流涕、噴嚏、咳嗽、頭痛等為主要表現(xiàn)，并伴隨有感冒夾痰、食滯之證[6]。故治療小兒感冒需以解表散熱為主，治療兼夾證則在解表的基礎(chǔ)上分別配合化痰、消導(dǎo)之法，虛弱者可采用扶正解表法[7]。

本實驗受試藥物小兒珠珀散由保和堂兒童感冒治療驗方珠珀猴棗散演變而來，具有多年兒童感冒治療史，復(fù)方由13味中藥組方而成，其中金銀花、防風(fēng)、薄荷疏風(fēng)散熱；猴棗、天竺黃清心化痰；珍珠、琥珀、茯苓、鉤藤安神定驚；冰片醒神開竅；麥芽、神曲消食化積，健脾和胃；甘草祛痰止咳，補(bǔ)脾益氣。諸藥合用，共奏祛風(fēng)清熱、安神定驚、化痰順氣、開胃消積之功效[8-10]。本實驗擬利用經(jīng)典的藥理學(xué)實驗方法探討小兒珠珀散的解熱、止咳祛痰作用及其對消化道的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 美國癌癥研究所(ICR)小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0002；清潔級新西蘭白兔，雌雄各半，2.0～2.5 kg，購于北京興隆實驗動物養(yǎng)殖中心，許可證號：SCXK(京)2016-0003，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動物室，許可證號：SYXK(京)2016-0038。

1.1.2 藥品和試劑 小兒珠珀散(香港保和堂制藥有限公司，實驗劑量依據(jù)臨床兒童用藥設(shè)定)；醋酸地塞米松(天津力生制藥股份有限公司，批號1605019)；沐舒坦(上海勃林格翰藥業(yè)公司，批號A42044)；咳必清(國藥集團(tuán)容生制藥有限公司，批號16090711)；健胃消食片(江中藥業(yè)股份有限公司，批號16120095)；阿司匹林泡騰片(阿斯利康制藥有限公司，批號H32026201)。二甲苯(北京化工廠，批號20170506)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，Whatman，批號BS0308)；酚紅(Sigma，批號51N00120)；碳酸氫鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，批號20160819)；可溶性淀粉(國藥集團(tuán)，批號20170414)；石蠟油(北京鼎國生物技術(shù)有限公司)；安琪高活性酵母(安琪酵母股份有限公司)。

1.1.3 儀器 YLS-25A型電動耳腫打孔器(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司)；ME104E型分析天平(METTLER TOLEDO)；YLS-7C型足趾容積測量儀(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司)；FLUO star Omega全自動多功能酶標(biāo)儀(BMG LABTECH)；MNT-150型游標(biāo)卡尺(上海美奈特實業(yè)有限公司)；980型醫(yī)用超聲霧化器(上海新天緣醫(yī)療用品有限公司)；ST 5000 型pH計(奧豪斯儀器有限公司)；Biofuge Primo型離心機(jī)(美國Thermo Scientific)；獸用體溫計(山東尚農(nóng)電子科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 用藥劑量 小兒珠珀散兒童最大用量為1.8 g/d，實驗用動物均為成年動物，因此用藥劑量按照成年人推算，擬定兒童體質(zhì)量為20 kg，成人體質(zhì)量為60 kg，實驗用藥擬按照兒童用藥3倍計算，實驗劑量換算為5.4 g/d，經(jīng)換算得小鼠等效劑量為0.9 g/kg，家兔等效劑量為0.36 g/kg。

1.2.2 小兒珠珀散抗炎作用研究 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、地塞米松組(1.90 mg/kg)、小兒珠珀散高劑量組(1.80 g/kg)、中劑量組(0.90 g/kg)、低劑量組(0.45g/kg)，每組 16只。受試藥物均以0.5% CMC-Na混懸，灌胃給藥，0.1 mL/10 g，每日1次，連續(xù)7 d，正常對照組及模型組灌胃等量CMC-Na。實驗前禁食不禁水12 h，末次給藥1 h后，移液器吸取二甲苯20 μL均勻涂抹于右耳(兩面)，0.5 h后，頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用電動耳腫打孔器于左右耳相同部位取直徑8 mm的耳片，稱質(zhì)量，觀察各組差異，并計算腫脹度及腫脹抑制率。腫脹度(mg)=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量；腫脹抑制率(%)=(模型組腫脹度-給藥組腫脹度)/模型組腫脹度×100%。

1.2.3 小兒珠珀散祛痰作用研究 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，即正常對照組、沐舒坦組(20 mg/kg)、小兒珠珀散高劑量組(1.80 g/kg)、中劑量組(0.90 g/kg)、低劑量組(0.45 g/kg)，每組16只，雌雄各半。受試藥物均以0.5% CMC-Na混懸，灌胃給藥，0.1 mL/10 g，每日1次，連續(xù)7 d，正常組灌胃等量CMC-Na。末次給藥30 min后，腹腔注射0.5 %的酚紅溶液 0.1 mL/10 g，30 min后處死動物，背位固定，沿頸部正中剪開皮膚，剝離氣管周圍組織，暴露氣管，自甲狀軟骨下及氣管分支處分別結(jié)扎，剪下氣管，放入盛有2 mL 5%的碳酸氫鈉溶液的EP管中，靜置30 min。酶標(biāo)儀測定546 nm波長處OD值。做酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算氣管酚紅排泌量。

1.2.4 小兒珠珀散止咳作用研究 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實驗前禁食不禁水12 h，置于5 000 mL自制玻璃裝置內(nèi)，打開霧化器，恒壓噴入25%氨水，持續(xù)30 s，觀察小鼠的咳嗽反射(腹肌強(qiáng)烈收縮，同時張嘴呼氣為準(zhǔn))，1 min內(nèi)咳嗽次數(shù)≥3次判定為引咳初篩合格。取初篩合格的80只小鼠，按體質(zhì)量隨機(jī)分成5組，即模型組、咳必清組(16.67 mg/kg)、小兒珠珀散高劑量組(1.80 g/kg)、中劑量組(0.90 g/kg)、低劑量組(0.45 g/kg)，每組12只，雌雄各半。受試藥物均以0.5% CMC-Na混懸，灌胃給藥，0.1 mL/10 g，每日1次，連續(xù)7 d，模型組小鼠灌胃給予等量CMC-Na。末次給藥1 h后，將小鼠置于上述裝置，秒表記錄時間，觀察小鼠咳嗽潛伏期(從開始噴霧到出現(xiàn)第一次咳嗽的時間)及3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)，并計算抑咳率。抑咳率(%)=(模型組小鼠咳嗽次數(shù)-給藥組小鼠的咳嗽次數(shù))/模型組小鼠咳嗽次數(shù)×100%。

1.2.5 小兒珠珀散解熱作用研究 家兔適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，適應(yīng)性測定家兔體溫：將涂有石蠟油的電子體溫計插入家兔直腸內(nèi)6 cm(在6 cm處用膠帶固定，確保插入的深度一致)，待穩(wěn)定后記錄肛溫。選取基礎(chǔ)溫度在38.5 ℃～39.5 ℃，且波動在0.4 ℃內(nèi)的家兔納入實驗。選取符合標(biāo)準(zhǔn)的家兔共50只，雌雄各半，按給藥劑量隨機(jī)分為 5組：模型組、阿司匹林組(0.13 g/kg)、珠珀散高劑量組(0.72 g/kg)、中劑量組(0.36 g/kg)、低劑量組(0.18 g/kg)，每組10只，受試藥物均以0.5% CMC-Na混懸，灌胃給藥，10 mL/kg，每日1次，連續(xù)7 d，模型組灌胃等體積CMC-Na。末次給藥前測定基礎(chǔ)體溫，并于給藥后 40 min，耳緣靜脈注射LPS 200 ng/kg(1 mL/kg)，于注射后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h檢測體溫，計算各組家兔體溫差(致熱后體溫-基礎(chǔ)體溫)。

1.2.6 小兒珠珀散促胃腸運(yùn)動作用研究 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按給藥劑量隨機(jī)分為5組，即正常組、嗎丁啉組(5.50 mg/kg)、小兒珠珀散高劑量組(1.80 g/kg)、中劑量組(0.90 g/kg)、低劑量組(0.45 g/kg)，每組16只。受試藥物均以0.5% CMC-Na混懸，灌胃給藥，0.1 mL/10 g，每日1次，連續(xù)15 d，正常對照組灌胃給予等量CMC-Na溶液。參考文獻(xiàn)報道[11]，實驗前禁食不禁水 24 h，末次給藥后1 h，灌胃營養(yǎng)性半固體糊(10 g CMC-Na，溶于蒸餾水250 mL中，分別加入奶粉16 g、糖8 g、淀粉8 g和墨汁2 mL，攪拌均勻，配制成300 mL(300 g)黑色半固體營養(yǎng)糊，每只小鼠灌胃0.5 mL。20 min后，脫頸椎處死動物。打開腹腔，結(jié)扎賁門、幽門，取出胃，稱質(zhì)量(胃全質(zhì)量)，沿胃大彎剪開，洗凈胃內(nèi)容物，稱質(zhì)量(胃凈質(zhì)量)，計算胃排空率；分離腸系膜，剪取幽門至回盲部的腸管，置于平板上，輕輕拉成直線，平鋪于白紙上，分別測量從幽門到回盲部和從幽門到墨汁前沿的距離，計算小腸推進(jìn)率。胃排空率(%)=[灌胃量-(胃全質(zhì)量-胃凈質(zhì)量)]/灌胃量×100%；小腸推進(jìn)率(%)=墨汁推進(jìn)長度/小腸總長度×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小兒珠珀散對小鼠耳腫脹度的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠耳腫脹度增加(P<0.01)，表明模型建立成功；與模型組比較，各給藥組小鼠耳腫脹度均減少(P<0.01)，但量效關(guān)系不明顯。小兒珠珀散高、低劑量組腫脹抵制率較高，與地塞米松作用相近，表明小兒珠珀散對二甲苯引起的小鼠耳腫脹具有一定的抑制作用，見表1。

表1 小兒珠珀散對小鼠耳腫脹的影響(n=16)

2.2 小兒珠珀散對小鼠氣管酚紅排泌量的影響

與正常對照組比較，沐舒坦可以顯著增加小鼠氣管酚紅排出量(P<0.01)，小兒珠珀散不同劑量均可顯著增加小鼠氣管酚紅排出量(P<0.01)，并表現(xiàn)出一定的量-效關(guān)系，但酚紅排出促進(jìn)作用低于陽性藥沐舒坦(P<0.05)，見表2。

表2 小兒珠珀散對氣管酚紅排泌量的影響(n=16)

2.3 小兒珠珀散對小鼠咳嗽的影響

與模型組比較，咳必清可延長小鼠咳嗽潛伏期(P<0.05)，減少咳嗽次數(shù)(P<0.01)。小兒珠珀散低劑量可延長小鼠咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)(P<0.05)，其延長咳嗽潛伏期作用與咳必清相近；中劑量減少小鼠咳嗽次數(shù)(P<0.01)與咳必清較為接近，但對潛伏期延長作用不明顯；高劑量表現(xiàn)出延長咳嗽潛伏期和減少咳嗽次數(shù)的趨勢，與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 小兒珠珀散對小鼠咳嗽的影響(n=16)

2.4 小兒珠珀散對家兔體溫的影響

與模型組比較，阿司匹林在1～4 h均可抑制家兔體溫升高(P<0.05)。小兒珠珀散高劑量在3～5 h可抑制家兔體溫升高(P<0.05)；中劑量在2～5 h具有抑制家兔體溫升高的作用(P<0.05)；低劑量在1.5 h以及5 h時與體溫變化與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。小兒珠珀散與阿司匹林比較，起效較慢，表明小兒珠珀散有一定的抑制LPS引發(fā)的家兔發(fā)熱的作用。見表4。

表4 小兒珠珀散對家兔發(fā)熱的影響(n=10)

2.5 小兒珠珀散對小鼠胃腸推進(jìn)作用的影響

與正常對照組比較，嗎丁啉可增加小鼠胃排空率和小腸推進(jìn)率(P<0.05)。小兒珠珀散低劑量可增加小鼠胃排空率和小腸推進(jìn)率，作用與嗎丁啉相近(P<0.05)；小兒珠珀散高、中劑量增加小鼠胃排空率(P<0.05)，對小腸推進(jìn)促進(jìn)作用不明顯。見表5。

表5 小兒珠珀散對小鼠胃腸動力的影響(n=16)

3 討論

小兒珠珀散中多味藥物均為臨床常用藥，現(xiàn)代藥理研究已證明組方中多味藥物對感冒具有一定的治療作用。謝新華等[12]研究表明，金銀花單用具有一定的解熱作用，并初步探索其解熱機(jī)制。Kuang Y等[13]發(fā)現(xiàn)甘草多種成分均可有效降低氨水誘咳動物的咳嗽次數(shù)，亦有研究表明神曲中多種消化酶對消化不良具有一定的治療作用。小兒珠珀散通過合理組方，可針對性治療兒童感冒過程中出現(xiàn)的多種癥狀。

感冒通常被認(rèn)為是上呼吸道急性炎癥，呼吸道分泌多種炎癥產(chǎn)物，即為痰液[14]。痰液可刺激呼吸道黏膜，引發(fā)咳嗽，加重感冒病情?？人允菣C(jī)體正常的保護(hù)反應(yīng)，使機(jī)體排出病原物，但頻繁劇烈的咳嗽可能會造成支氣管痙攣，加重肺部疾病[15]。同時由于病毒、細(xì)菌等外源性致熱原侵入機(jī)體刺激致熱原細(xì)胞產(chǎn)生和釋放內(nèi)生致熱原，刺激機(jī)體體溫調(diào)節(jié)中樞，升高體溫[16]。持續(xù)高熱，會威脅患者生命安全，應(yīng)及時進(jìn)行干預(yù)。兒童往往由于高熱不退，出現(xiàn)食欲不振，消化不良等情況[17]。

二甲苯可誘導(dǎo)組胺、激肽及纖維蛋白溶解酶等炎癥介質(zhì)釋放，引起局部毛細(xì)血管通透性增加、急性滲出性炎性水腫等，中藥新藥抗炎實驗中常以二甲苯為致炎劑評價藥物抗炎作用[18]；祛痰實驗利用酚紅為指示劑，在祛痰藥的影響下，支氣管分泌液增加，呼吸道黏膜排出的酚紅越多，支氣管中酚紅濃度越高[19]；止咳實驗中采用氨水霧化吸入刺激小鼠副交感神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)咳嗽反射[20]。發(fā)熱實驗常選用內(nèi)毒素刺激家兔，使其體溫調(diào)節(jié)中樞的調(diào)定點上移[21]；胃腸蠕動實驗中常采用營養(yǎng)性半固體糊模擬食物在小鼠胃腸道的消化作用。本實驗中，小兒珠珀散可降低小鼠耳腫脹度，抑制炎癥反應(yīng)；可增加小鼠氣管酚紅的分泌量，具有顯著的祛痰作用；同時小兒珠珀散可有效減少氨水刺激小鼠咳嗽的次數(shù)，說明其具有一定的止咳作用；還具有抑制LPS引起的家兔體溫升高、促進(jìn)小鼠胃排空、增強(qiáng)小腸推進(jìn)的作用。

小兒珠珀散用于治療小兒感冒，有多年臨床經(jīng)驗，廣泛應(yīng)用于多個地區(qū)，可有效治療兒童感冒的發(fā)熱、咳嗽、咳痰等癥狀，同時有效改善兒童感冒期間消化不良的問題，但是相關(guān)實驗研究較少，因此本實驗利用經(jīng)典的藥效學(xué)實驗方法，針對不同的感冒癥狀分別進(jìn)行相應(yīng)的動物實驗，驗證其藥效。本研究結(jié)果為小兒珠珀散臨床治療感冒提供了參考，希望能為新藥研發(fā)提供更多資料，促進(jìn)新藥研發(fā)實驗工作的展開。