金蓉，劉冬云，胡素娟，林榮軍

(青島大學附屬醫(yī)院，山東青島 266000)

微小RNA(miRNA)是真核生物中一類長度為18～25個核苷酸的內源性非編碼RNA，具有高度保守性、時序性和組織特異性，主要通過與靶基因mRNA的3’UTR上的互補區(qū)域結合，在轉錄后水平負性調控靶基因的表達，參與生物的發(fā)育、增殖、分化、凋亡過程[1-3]。哮喘是一種遺傳易感性的慢性氣道炎癥性疾病，涉及多種細胞、細胞因子以及與免疫調節(jié)密切相關的信號通路[4]。越來越多的研究證據(jù)表明，多種miRNA參與哮喘的氣道炎癥調節(jié)[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，雞卵白蛋白(OVA)誘導的哮喘小鼠體內微小RNA410(miR-410)含量較對照組明顯降低，考慮miR-410可能參與哮喘發(fā)病過程。本研究擬通過生物信息學方法預測miR-410與IL-13基因的結合位點，并通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-410對IL-13基因的直接靶向關系，為進一步探索miR-410在哮喘發(fā)病機制中的作用提供參考。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

雙熒光素酶檢測系統(tǒng)、psiCHECK-2(promega)；多功能酶標儀(SpectraMax i3x，Molecular Devices)；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-1200，上海天能科技有限公司)；大腸埃希菌菌株DH5α、293T細胞、miR-410模擬物和miRNA無義序列陰性對照、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；IL-13目的基因序列和突變序列(Invitrogen)；限制性內切酶XhoI和NotI、T4 DNA連接酶、DNA ladder(Fermentas)；質粒DNA抽提試劑盒(Qiagen)；KOD高保真酶PCR試劑盒、Taq酶(TOYOBA)。

1.2 方法

1.2.1 生物學信息預測 利用靶基因預測軟件targetscan(http://www.targetscan.org)對miR-410靶向結合IL-13 3’UTR的位點進行分析，結合位點見圖1。

圖1 miR-410靶向結合IL-13 3’UTR的位點

1.2.2 雙熒光素酶報告載體的構建和鑒定 分別化學合成IL-13 mRNA結合位點的野生型和突變型序列的正義鏈和反義鏈，目的片斷插入XhoI、NotI位點。用XhoI、NotI 37 ℃酶切psiCHECK-2載體回收線性化載體片段。目的基因片段與線性化載體連接，將連接產物轉化感受態(tài)細胞，篩選質?？寺?，提取質粒DNA，分別進行酶切鑒定及測序鑒定。

1.2.3 細胞轉染 事先準備好用于轉染的分到96孔板中的293T細胞和目的質粒。將10 μL DMEM與0.16 μL的psiCHECK-IL-13-wt/mut目的質粒以及miR-410-3p/Negative Control(NC)充分混勻后室溫放置(溶液A)，之后將10 μL DMEM與0.3 μL的轉染試劑充分混勻(溶液B)，室溫放置5 min。將溶液A與溶液B充分混勻，室溫放置20 min。轉染前為細胞換取新鮮培養(yǎng)基，之后將轉染混合物加入混勻。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。轉染6 h后換取新鮮培養(yǎng)基，轉染48 h后收集細胞檢測。

1.2.4 熒光素酶報告基因驗證 以96孔板每孔100 μL的量加入細胞懸液，室溫搖床上緩慢搖15 min后，將細胞裂解液吸至1.5 mL離心管，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液移入新的管子；96孔板中加入Luciferase Assay Reagent Ⅱ(LAR Ⅱ)工作液100 μL，加入20 μL細胞裂解液，移液槍吹打混勻2～3次，測定記錄Firefly luciferase(Fl)值(內參值)。加入100 μL Stop & Glo Reagent，移液槍吹打混勻2～3次，測定記錄Renilla luciferase(Rl)值，即為報告基因發(fā)光值。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 熒光素酶報告基因載體酶切分析

psiCHECK-IL-13-wt/mut質粒提取后應用XhoI、NotI雙酶切，結果psiCHECK-IL-13-wt/mut在相應片段大小的位置切出來載體條帶和目的DNA片段，釋放出約500 bp大小的片段。見圖2。

圖2 psiCHECK-IL-13-wt/mut質粒的酶切鑒定

2.2 熒光素酶報告基因測序分析

將含有miR-410結合位點的野生型和突變型序列的IL-13 mRNA載體進行測序，結果表明野生型和突變型IL-13 mRNA熒光素酶報告載體均構建成功。見圖3。

A

2.3 熒光素酶活性測定

將miR-410模擬物與野生型載體psiCHECK-IL-13-wt共轉染293T細胞后，細胞熒光素酶活性明顯下降，與突變型載體psiCHECK-IL-13-mut比較差異有統(tǒng)計學意義(t=5.697，P<0.01)；與對照組NC結合野生型psiCHECK-IL-13-wt載體比較，熒光素酶活性降低(t=2.852，P<0.05)。見圖4。

圖4 熒光素酶活性測定

3 討論

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由包括嗜酸粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等多種細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[6]。近年來miRNAs在哮喘發(fā)生發(fā)展中的作用引起眾多關注。miRNA是一種由18～25個核苷酸組成的非編碼RNA，其功能強大，能夠通過與靶基因mRNA的非編碼區(qū)的結合位點結合并參與基因轉錄后的調控和基因的降解[7]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA在哮喘發(fā)病機制中具有重要作用[8-10]。Williams A E等[11]發(fā)現(xiàn)，哮喘患者肺組織中miR-92、miR-26a、miR-200c、miR-16、let-7b、miR-125、let-7及miR-26的含量與正常對照組存在差異。Kumar M等[12]研究證實，let-7在緩解哮喘氣道炎癥、降低氣道高反應性、防止黏膜上皮細胞化生及上皮細胞纖維化方面的作用。本課題組前期研究顯示，miR-410在OVA誘導的過敏性哮喘小鼠模型中的表達水平明顯低于對照組小鼠，提示miR-410可能參與過敏性哮喘的發(fā)病過程[13]。

在過敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中，Th2型細胞因子如IL-4、IL-5、IL-13對炎癥細胞如巨噬細胞、嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞的浸潤起到重要作用[14-16]。IL-13主要由Th2細胞、肥大細胞、單核巨噬細胞在活化狀態(tài)下分泌。IL-13誘導B淋巴細胞合成大量的IgE抗體同時增加嗜酸粒細胞的募集，引起氣道上皮細胞表達誘導型一氧化氮合酶(iNOS)，誘導黏液產生和杯狀細胞增殖，刺激氣道平滑肌收縮，提高細胞外膠原蛋白和纖維母細胞向成肌纖維細胞表型轉變等[17]。IL-13能夠通過IL-13 Rα1與IL-4R形成受體復合物，參與信號轉導,激活靶基因轉錄，誘導Th0細胞分化、氣道炎癥、氣道高反應、黏液產生。IL-13主要通過氣道上皮細胞、平滑肌細胞來調節(jié)哮喘個體小氣道嗜酸粒細胞的募集[18]。抑制Th2型細胞因子，特別是IL-13的促炎作用是哮喘免疫治療的一個發(fā)展方向[19]。目前已經開發(fā)出抗IL-4抗體、抗IL-5抗體以及抗IL-13抗體等抑制相關炎癥因子的單克隆抗體[20]。相關研究[21-22]發(fā)現(xiàn)，抗IL-5抗體及抗IL-13抗體組可明顯抑制OVA誘導的哮喘小鼠肺部嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等炎癥細胞浸潤。但是單克隆抗體制作工藝相對較長，還存在安全、免疫原性等一系列問題[23-24]。因此，從哮喘發(fā)生機制靶基因方面，本研究試圖探討某種靶向治療哮喘Th2因子相關的藥物，從而阻斷過敏性哮喘的發(fā)生和發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-410在體外試驗方面能夠抑制IL-13 mRNA熒光素酶載體的熒光素活性，證實了miR-410能夠靶向調控IL-13 mRNA。

本研究通過生物信息學軟件targetscan預測發(fā)現(xiàn)了IL-13 3’ UTR存在可能被miR-410結合的潛在靶點，通過構建psiCHECK-2雙熒光素酶報告基因載體，從體外試驗層面驗證了miR-410對IL-13 mRNA的靶向結合作用，提示miR-410能夠靶向調控IL-13 mRNA，從而影響其轉錄及表達。本研究確定了miR-410和IL-13 mRNA的靶向調控關系，為進一步在體內試驗層面上研究其在哮喘發(fā)病中的作用奠定了基礎。