史亮

（貝克曼庫(kù)爾特生物科技（蘇州）有限公司，江蘇 蘇州 215000）

流式細(xì)胞分析屬于現(xiàn)代分析技術(shù)，它是對(duì)不同科研領(lǐng)域、不同學(xué)術(shù)背景科學(xué)家心血的凝結(jié)，是綜合運(yùn)用各學(xué)科知識(shí)的結(jié)晶，例如生物物理學(xué)、有機(jī)化學(xué)、分子生物學(xué)、高等數(shù)學(xué)、生物技術(shù)、電子技術(shù)等?，F(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)更是在諸多的研究領(lǐng)域中具有十分廣泛的應(yīng)用。各個(gè)相關(guān)學(xué)科發(fā)展史的縮影體現(xiàn)了流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展史。

1 發(fā)展歷史

1953年，通過(guò)分層鞘流原理，將紅細(xì)胞光學(xué)自動(dòng)計(jì)數(shù)器成功地設(shè)計(jì)出來(lái)；同年，研究出流式細(xì)胞儀的雛形；1954年，將光電粒子計(jì)數(shù)器發(fā)明出來(lái)；1959年，出現(xiàn)B 型 Coulter計(jì)數(shù)器；1965年， Kamemtsky 等將兩個(gè)設(shè)想提出來(lái)：（1）通過(guò)分光光度計(jì)對(duì)細(xì)胞成分進(jìn)行定量；（2）與測(cè)量值有效結(jié)合，對(duì)細(xì)胞予以分類；1967年，將細(xì)胞分選的方法提出來(lái)；1969年，第一臺(tái)熒光檢測(cè)細(xì)胞計(jì)問世；1972年，改進(jìn)了細(xì)胞分選器；1975年，將單克隆抗體技術(shù)提出來(lái)?，F(xiàn)階段，在不斷發(fā)展光電技術(shù)的影響作用下，逐漸模塊化發(fā)展流式細(xì)胞儀，能夠根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求對(duì)其電子系統(tǒng)、檢測(cè)器單元及光學(xué)系統(tǒng)等隨意更換。21世紀(jì)，已經(jīng)逐漸完善了流式細(xì)胞術(shù)，在細(xì)胞分析學(xué)領(lǐng)域，它已經(jīng)成為一個(gè)十分重要的工具。

2 工作原理

流式細(xì)胞儀由分析系統(tǒng)、電子系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、液流系統(tǒng)四個(gè)部分組成。它只可以對(duì)懸浮的微?；騿渭?xì)胞的信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。熒光染色待測(cè)的微?；蚣?xì)胞后，將懸液標(biāo)本制成，在氣體壓力的作用下將待測(cè)樣本向流動(dòng)室內(nèi)壓入，在高壓下將不含微?；蚣?xì)胞的緩沖液從鞘液管中噴出，將一個(gè)圓形的流束形成，在鞘液的包裹下，待測(cè)細(xì)胞單行排列，在流式細(xì)胞儀的檢測(cè)區(qū)域依次通過(guò)，通過(guò)激發(fā)光激后將熒光信號(hào)產(chǎn)生。以激光為激光光源，流式細(xì)胞儀能夠通過(guò)聚焦整形后的光束在樣品流上垂直照射，在激光束的照射下，被熒光染色的細(xì)胞會(huì)將激發(fā)熒光和散射光產(chǎn)生。在前向小角度對(duì)光散射信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，此為前向散射，此信號(hào)可以對(duì)細(xì)胞體積的大小進(jìn)行反映。熒光信號(hào)的強(qiáng)度能夠?qū)λ鶞y(cè)細(xì)胞膜表面抗原的強(qiáng)度進(jìn)行反映，通過(guò)光電倍增管接受后可以向電信號(hào)轉(zhuǎn)換，再利用模轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號(hào)向可以被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)轉(zhuǎn)換。計(jì)算機(jī)計(jì)算處理采集所測(cè)量到的各種信號(hào)，并在計(jì)算機(jī)屏幕上顯示結(jié)果，或?qū)⑵浯蛴〕鰜?lái)，或在硬盤上存儲(chǔ)，以便進(jìn)行深入的分析。

3 流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用

3.1 在醫(yī)學(xué)中流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用

3.1.1 應(yīng)用于免疫學(xué)中

隨著熒光色素化學(xué)、單克隆抗體技術(shù)的不斷發(fā)展，流式細(xì)胞儀已經(jīng)成為一種“雜交體”。流式細(xì)胞儀存在定量、靈活、快速等特點(diǎn)，在臨床實(shí)踐應(yīng)用和免疫理論研究等方面具有十分廣泛的應(yīng)用，在現(xiàn)代免疫技術(shù)中，它占據(jù)著十分重要的地位。特別是結(jié)合應(yīng)用單克隆抗體，在機(jī)體免疫狀態(tài)的監(jiān)督、免疫分選、免疫分型等方面的作用非常重要。在不斷完善和充實(shí)流式細(xì)胞測(cè)定技術(shù)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、病理學(xué)及細(xì)胞學(xué)的研究發(fā)展中，它不僅可以補(bǔ)充熒光顯微鏡，且存在兩者的全部特點(diǎn)和功能，所以在各學(xué)科領(lǐng)域、免疫學(xué)中發(fā)揮著十分重要的作用。

3.1.2 應(yīng)用于腫瘤學(xué)中

通過(guò)流式細(xì)胞分析對(duì)細(xì)胞凋亡、耐藥蛋白、癌基因蛋白產(chǎn)物、細(xì)胞表面標(biāo)志、細(xì)胞增殖標(biāo)志物進(jìn)行定量分析檢測(cè)，同時(shí)實(shí)施DNA倍體分析、細(xì)胞周期分析等，以便將組織形態(tài)學(xué)無(wú)法得到的信息獲取到，便于預(yù)防和治療腫瘤，并對(duì)腫瘤實(shí)施臨床診斷。定量分析腫瘤細(xì)胞的DNA含量，對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行解析，利用細(xì)胞異倍體對(duì)各種腫瘤的預(yù)后情況進(jìn)行預(yù)測(cè)，同時(shí)可以在化療期間指導(dǎo)化療的時(shí)間、強(qiáng)度及藥物的選擇等。對(duì)抗癌藥物的作用機(jī)制進(jìn)行解析，在早期鑒別和診斷良惡性癌癥方面具備重要的參考價(jià)值。除此之外，因流式細(xì)胞分析在研究抗癌基因、癌細(xì)胞、周期蛋白及凋亡等方面的作用也十分重要，近年來(lái)，腫瘤研究者對(duì)它的關(guān)注度越來(lái)越高，在腫瘤的臨床和基礎(chǔ)研究中已經(jīng)得到十分廣泛的應(yīng)用，在腫瘤預(yù)后預(yù)測(cè)、療效評(píng)價(jià)及診斷中發(fā)揮著關(guān)鍵的參考價(jià)值。在腫瘤治療過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)藥物的耐受性是其主要的障礙。對(duì)于腫瘤細(xì)胞來(lái)說(shuō)，它主要包括繼發(fā)性耐藥和原發(fā)性耐藥兩種類型，在化療之前原發(fā)性耐藥在腫瘤細(xì)胞中存在，和用藥沒有關(guān)系，繼發(fā)性耐藥的發(fā)生和化學(xué)藥物有關(guān)，也就是說(shuō)在使用藥物之前對(duì)藥物存在一定的敏感性，其耐藥在用藥后產(chǎn)生。按照耐藥譜的不同，將激發(fā)耐藥分為兩種類型，即多藥耐藥和原藥耐藥，多藥耐藥相關(guān)蛋白有多藥耐藥相關(guān)蛋白、P糖蛋白等，均為ATP酶活性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，均會(huì)利用藥物外排泵的作用，使細(xì)胞中藥物的聚集降低。所以可以通過(guò)流式細(xì)胞分析對(duì)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，在臨床腫瘤化療藥物的選擇和化療效果的監(jiān)測(cè)方面發(fā)揮著十分重要的意義。

3.2 流式細(xì)胞術(shù)新技術(shù)的應(yīng)用

3.2.1 液相芯片技術(shù)

近年來(lái)，在不斷發(fā)展蛋白質(zhì)組計(jì)劃和人類基因組計(jì)劃的影響作用下，在生命科學(xué)領(lǐng)域中，生物芯片技術(shù)這項(xiàng)新技術(shù)迅速發(fā)展起來(lái)，且大家對(duì)它的關(guān)注度越來(lái)越高。有機(jī)地結(jié)合流式細(xì)胞分析和生物芯片技術(shù)，在各種有熒光的微球上標(biāo)記不同生物的蛋白、核酸等，在液相系統(tǒng)中以熒光標(biāo)記微球?yàn)榉磻?yīng)載體將生物學(xué)反應(yīng)完成，也就是流式細(xì)胞術(shù)液相芯片技術(shù)。生物芯片技術(shù)能夠在同一液相中對(duì)多個(gè)目的分子進(jìn)行檢測(cè)。例如檢測(cè)血液中的多種白細(xì)胞介素。

3.2.2 定量流式細(xì)胞分析

對(duì)于定量流式細(xì)胞分析來(lái)說(shuō)，它是通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)定量分析微?；蚣?xì)胞上標(biāo)記的熒光分子，以便精確地測(cè)量細(xì)胞的生物分子，例如每個(gè)分子表達(dá)的抗原數(shù)、平均分子數(shù)等。定量流式細(xì)胞分析和以往的陽(yáng)性細(xì)胞百分率或相對(duì)熒光強(qiáng)度的測(cè)量有所不同，其存在更加靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。例如在治療和研究非典和獲得性免疫缺陷綜合癥過(guò)程中，絕對(duì)記數(shù)外周血中的CD4+T 淋巴細(xì)胞，可以對(duì)臨床療效進(jìn)行監(jiān)測(cè)，同時(shí)能夠?qū)⒉∏榈倪M(jìn)展充分反映出來(lái)。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)具有非常廣泛的應(yīng)用，本文只是針對(duì)其中的一小部分進(jìn)行了介紹?，F(xiàn)階段，在迅速發(fā)展各項(xiàng)科學(xué)技術(shù)的影響作用下，流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用前景會(huì)更加廣闊。