唐雅楠，許金凱，韓喜桃，韓舒，劉凱洋，支美汝，劉子琴，李衛(wèi)飛，李飛，杜紅

北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488

知母來源于百合科植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根莖，味苦、甘，性寒，歸肺、胃、腎經(jīng)，具有清熱瀉火、生津潤燥的功效[1]。鹽知母是知母歷代的主流炮制品種，傳統(tǒng)理論認為，鹽炙可引藥入腎[2]。本課題組前期實驗與文獻報道也表明，知母鹽炙后滋陰降火作用增強[3-8]。

芒果苷是知母有效成分之一，也是《中華人民共和國藥典》2020年版規(guī)定的質(zhì)量控制成分之一[9]，具有抗炎[10-15]、保護腎功能[16-18]、增強免疫力[19-20]、抗病毒[21]、抗氧化[22-23]等作用。在炮制過程中，利用輔料與藥物相輔或相制的性味，可達到調(diào)整藥性、引藥歸經(jīng)、影響藥物作用趨向、增強臨床療效的目的。陳嘉謨在《本草蒙筌》中記載：“酒制升提，姜制發(fā)散，入鹽走腎臟仍仗軟堅……”[24]，明確提出鹽炙入腎理論。本實驗通過研究生、鹽知母水煎液中芒果苷在大鼠體內(nèi)的組織分布，以期從輔料作用論角度探討知母鹽炙后滋陰降火作用增強的機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠，40只，雄性，體質(zhì)量(200±20) g，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK-2016-0002。動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學屏障環(huán)境動物實驗室[動物使用許可證號：SYXK(京)2016-0038]，室溫(25±2) ℃，相對濕度為45%，12 h/12 h 光暗周期。實驗開始前進行適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.2 試藥

知母飲片購于北京雙橋燕京飲片廠，批號：1611103558，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學中藥鑒定與資源系王晶娟副教授鑒定為百合科植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根莖。鹽知母為本實驗室自制，工藝條件為取知母飲片100 g，加鹽水拌勻，悶透，在160～170 ℃條件下炒制20 min。每100 kg知母片用食鹽2 kg。

對照品芒果苷(上海源葉生物技術(shù)有限公司，批號：Y26M8H369263，純度≥98%)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，天津市福晨化學試劑廠)；甲醇、冰乙酸(色譜純，天津市四友精細化學品有限公司)；0.9%氯化鈉溶液(石家莊四藥有限公司，批號：1901013202)；水為超純水。

1.3 儀器

2965型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；BY-R20型高速冷凍低溫離心機(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)；FA1104B型分析天平(上海越平科學儀器有限公司)；ISO9001型十萬分之一天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；VORJEK5型渦旋震蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；MTN-5800型氮吹濃縮裝置(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SunFire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.2%乙酸水溶液，梯度洗脫(0～8 min，15%～25%A；8～12 min，25%A；12～15 min，25%～80%A；15～20 min，80%～15%A；20～25 min，15%A)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為25 ℃；進樣體積為20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取芒果苷對照品1.02 mg，于10 mL量瓶中用甲醇定容，得質(zhì)量濃度為102 μg·mL-1的對照品溶液，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

取適量芒果苷對照品溶液，用甲醇水溶液(40∶60)稀釋，得到質(zhì)量濃度為2 μg·mL-1的對照品稀釋液，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2供試品溶液的制備 芒果苷混懸液：取CMC-Na適量，加入一定量水，混勻，得到0.5%的CMC-Na混懸液。精密稱取芒果苷0.5 g，加入CMC-Na混懸液定容至25 mL，得到質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1的芒果苷混懸液。

知母水煎液：取生知母和鹽知母各100 g，10倍量水浸泡30 min后加熱回流 1 h，4層紗布濾過后，藥渣加8倍量水同法得二次濾液，合并藥液，濃縮，得以生藥量計質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的生、鹽知母水煎液(以芒果苷計分別為6.4、9.7 mg·mL-1)。

2.3 組織樣品收集

SD雄性大鼠40只，隨機分為對照組、芒果苷(200 mg·kg-1)組、生知母(10 g·kg-1)組、鹽知母(10 g·kg-1)組，每組10只，灌胃給藥前禁食12 h，可自由飲水，分別灌胃給予水、芒果苷混懸液、生知母水煎液和鹽知母水煎液，給藥量為10 mL·kg-1。灌胃2 h后處死，迅速取出肝、心、脾、肺、腎，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，濾紙擦干。精密稱取各組織0.5 g，用0.9%氯化鈉溶液制成25%組織勻漿，于-80 ℃下保存。

2.4 組織樣品處理

精密吸取200 μL組織勻漿于2 mL離心管中，加入600 μL乙腈乙酸溶液(40∶1)，充分振蕩1 min，4 ℃、13 000 r·min-1離心20 min(離心半徑為8.5 cm)，取上清液，35 ℃水浴氮氣吹干，殘渣加入200 μL甲醇水溶液(40∶60)復溶，離心，上清液濾過后進HPLC檢測。

2.5 統(tǒng)計方法

2.6 方法學驗證

2.6.1專屬性考察 取大鼠空白腎組織勻漿液、含芒果苷空白腎組織勻漿液、灌胃生知母水煎液后腎組織勻漿液，按2.4項下方法處理，按照2.1項下色譜條件進行分析，結(jié)果見圖1。色譜峰峰形良好，無雜峰干擾測定，專屬性良好。

注：A.空白腎組織；B.含芒果苷空白腎組織；C.灌胃生知母水煎液后腎組織。圖1 大鼠腎組織中芒果苷色譜圖

2.6.2標準曲線及定量下限考察 分別精密吸取2.2.1項下對照品稀釋液5.14、10.53、22.22、50.00、85.72、133.34、200.00 μL及對照品溶液6.18、12.78 μL，加入大鼠各空白組織勻漿200 μL，得質(zhì)量濃度約為50、100、200、400、600、800、1000、3000、6000 ng·mL-1的系列組織勻漿樣品。按2.4項下方法處理，2.1項下色譜條件檢測，建立標準曲線，得各回歸方程見表1，芒果苷在各組織勻漿中線性范圍為50～6000 ng·mL-1，定量下限為50 ng·mL-1，且線性關(guān)系良好，r≥0.999 3。

表1 芒果苷在大鼠各組織中的線性關(guān)系

2.6.3精密度和準確度考察 按2.6.2項下方法操作，每日制備含有低、中、高質(zhì)量濃度(50、600、6000 ng·mL-1)芒果苷的大鼠組織勻漿各6份，日內(nèi)連續(xù)進樣，連續(xù)測定3 d。精密度以日內(nèi)質(zhì)量濃度和日間質(zhì)量濃度的RSD表示，準確度以測得的實際質(zhì)量濃度與配制質(zhì)量濃度的比值表示。結(jié)果顯示，各組織勻漿中芒果苷測定的準確度在89.59%～101.11%，日內(nèi)精密度的RSD≤8.65%，日間精密度的RSD≤13.84%。

2.6.4提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察 按2.6.2項下方法操作，制備含有低、中、高質(zhì)量濃度(50、600、6000 ng·mL-1)芒果苷的大鼠組織勻漿各6份，按照2.4項下方法處理，2.1項下方法進樣檢測，得到峰面積A1。取空白組織勻漿200 μL，按2.4項下方法操作至氮氣吹干，殘渣用含低、中、高3個質(zhì)量濃度芒果苷的甲醇水溶液(40∶60)復溶，按照2.1項下方法進樣檢測，得到峰面積A2。直接用含低、中、高3個質(zhì)量濃度芒果苷的甲醇水溶液進樣分析，得峰面積A3。按照公式(1)～(2)計算提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)。

提取回收率=A1/A2×100%

(1)

基質(zhì)效應(yīng)=A2/A3×100%

(2)

結(jié)果顯示，提取回收率為58.06%～95.46%，RSD<15%，基質(zhì)效應(yīng)為71.43%～103.03%，RSD<12%，表明測定方法提取回收率良好，無基質(zhì)干擾。

2.6.5穩(wěn)定性考察 取含有低、中、高質(zhì)量濃度(50、600、6000 ng·mL-1)芒果苷的大鼠空白組織勻漿，按照2.4項下方法處理，考察樣品在室溫下放置3、24 h和凍融3次的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，各條件下各組織勻漿中芒果苷的穩(wěn)定性為89.18%～105.06%，RSD<11%，表明芒果苷在各條件下穩(wěn)定性較好。

2.7 芒果苷組織分布結(jié)果

灌胃芒果苷混懸液2 h后，大鼠各組織中芒果苷含量為肺>腎>脾>心≈肝。灌胃生、鹽知母水煎液2 h后，大鼠各組織中芒果苷含量為肺>腎>脾>肝>心(圖2)。生、鹽知母水煎液組與芒果苷組的分布規(guī)律相同，符合知母的歸經(jīng)特點。生、鹽知母水煎液中芒果苷在大鼠各組織中的含量均高于芒果苷組，但生、鹽知母水煎液中芒果苷在大鼠各組織中的含量差異無統(tǒng)計學意義。

注：與芒果苷組對應(yīng)組織比較，*P<0.05。圖2 芒果苷組及生、鹽知母水煎液組大鼠各組織中芒果苷質(zhì)量分數(shù)

3 討論

本實驗研究了給予生、鹽知母水煎液和芒果苷混懸液后大鼠體內(nèi)芒果苷在各組織的分布情況，結(jié)果表明，芒果苷主要分布在肺、腎中，該結(jié)論與知母的歸經(jīng)特點一致。芒果苷在肺、腎組織中的含量依次為鹽知母水煎液≈生知母水煎液>芒果苷混懸液。由灌胃劑量可知，芒果苷組的灌胃劑量(以芒果苷質(zhì)量分數(shù)計)分別是生、鹽知母組的3.1、2.1倍(實驗用飲片中生知母芒果苷質(zhì)量分數(shù)為0.64%，鹽知母芒果苷質(zhì)量分數(shù)為0.97%)，其芒果苷在各組織中的含量卻顯著小于生、鹽知母組，一方面可能是由于飲片在煎煮過程中促進芒果苷溶出或產(chǎn)生其他成分向芒果苷轉(zhuǎn)化，使水煎液中芒果苷含量增加；另一方面，中藥飲片中化學成分復雜，其他成分可能促進了芒果苷的溶出和吸收。鹽知母組大鼠腎臟組織中的芒果苷含量與生知母組相比差異無統(tǒng)計學意義。說明單以芒果苷的分布闡明鹽炙入腎的炮制理論尚沒有充分的科學依據(jù)，知母鹽炙后增強滋腎陰作用及作用機制需進一步探討。