曹佩，王剛，白璇姣，韓建萍

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥資源保護(hù)重點(diǎn)研究室，北京 100193

人參花、西洋參花和三七花分別來(lái)自于人參PanaxginsengC.A.Mey.、西洋參P.quinquefoliusL.和三七P.notoginseng(Burk.)F.H.Chen，近年來(lái)逐漸被作為“花茶”應(yīng)用于日常保健?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參花的主要有效成分為多糖和人參皂苷[1-2]，可以有效地提高人體免疫力、清除自由基，具有重要的應(yīng)用價(jià)值[3]。西洋參花多糖可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活性，是保健品和食品理想的原材料[4]。三七花中含有大量皂苷類、總酚類和黃酮類化合物及礦物質(zhì)，可以抑制人體內(nèi)自由基的生成，也逐漸被作為營(yíng)養(yǎng)添加劑應(yīng)用于食品和藥品中[5]。但是三者均以總花梗短、小花團(tuán)聚為特征，外觀可分辨度低，在干燥之后作為花茶更加難以辨認(rèn)。此外，化學(xué)成分的相似性也從一定層面上增加了其鑒定難度。孟祥松等[6]采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)人參花、西洋參花和三七花鑒別時(shí)發(fā)現(xiàn)，人參花中獨(dú)有人參皂苷Rg1峰，三七花中獨(dú)有人參皂苷Rb1峰，除此之外，在化學(xué)成分上無(wú)明顯差異。當(dāng)出現(xiàn)人參花與西洋參花、西洋參花與三七花混雜時(shí)，化學(xué)方法難以鑒定真?zhèn)?。因此，運(yùn)用傳統(tǒng)鑒別方法對(duì)這3種花蕾進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別難度極大。

DNA條形碼分子鑒定方法是基于分子生物學(xué)和生物信息學(xué)，結(jié)合不同物種基因組中一段公認(rèn)且相對(duì)較短的DNA序列的高效物種鑒定方法，已成功應(yīng)用于植物、動(dòng)物和部分深加工產(chǎn)品的鑒定中[7-9]。對(duì)于植物而言，DNA條形碼分子鑒定體系主要包括核心鑒定序列內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)和輔助鑒定序列psbA-trnH[10]。ITS2序列具有擴(kuò)增效率高、種內(nèi)較為保守、種間變異大等優(yōu)點(diǎn)[11]，已成功應(yīng)用于眾多藥用植物的鑒定中。研究發(fā)現(xiàn)，ITS2條形碼聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增成功率(93.8%)高于psbA-trnH(92.8%)和ITS(42.3%)，且在4800余種、6600多份的植物樣本中，ITS2(92.7%)條形碼的鑒定效率高于psbA-trnH(67.6%)。在ITS2條形碼的基礎(chǔ)上，利用單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)可實(shí)現(xiàn)近緣物種間的鑒別[11]。根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果，利用人參和西洋參的SNP位點(diǎn)可以準(zhǔn)確鑒定出人參和西洋參。當(dāng)人參和西洋參以1∶19混合時(shí)，在SNP處可出現(xiàn)雙峰，且峰高[西洋參的主峰鳥(niǎo)嘌呤(G)/腺嘌呤(A)高于人參的主峰A/G)]可大致反映摻雜比例[12]。

本研究收集市售人參花6份、西洋參花9份和三七花7份，基于ITS2序列對(duì)其進(jìn)行鑒定，并建立了快速鑒別兩兩混合物的SNP雙峰法，以期為市場(chǎng)上人參花、西洋參花和三七花的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 試藥

人參花、西洋參花和三七花樣品購(gòu)買于不同藥材市場(chǎng)及道地產(chǎn)區(qū)，共計(jì)22份。其中，人參花 6份、西洋參花9份、三七花樣品7份(表1和圖1)。由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員對(duì)人參花、西洋參花和三七花進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，分別為人參PanaxginsengC.A.Mey.、西洋參P.quinquefoliusL.和三七P.notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥花蕾。

DP316植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；2×Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) Master Mix(北京艾德萊生物科技有限公司)；引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。

1.2 儀器

MM400型冷凍混合球磨儀(德國(guó)Retsch公司)；LUX-24型數(shù)顯恒溫水浴鍋(北京陸?？萍加邢薰?；846-x-070-301型PCR儀(德國(guó)Biometra公司)；移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；D-37250型冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；GelDoc XR+IMAGELAB型凝膠成像儀(德國(guó)Bio-Rad公司)。

表1 西洋參花、三七花、人參花樣品信息

注：A.人參花；B.西洋參花；C.三七花；圖2同。圖1 人參花、西洋參花和三七花

2 方法

2.1 DNA提取

取人參花、西洋參花和三七花樣品20 mg；對(duì)于混合樣品，將已鑒定為正品的人參花、西洋參花和三七花打粉，過(guò)二號(hào)篩，以2∶8、2∶10、8∶2和10∶2兩兩均勻混合，取混合后的植物粉末20 mg。采用球磨儀研磨2 min(30 Hz)。使用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。研磨后的樣品加入裂解液后，將其置于65 ℃水浴2 h，用-20 ℃異丙醇沉淀DNA，其余步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行[13]。

2.2 PCR擴(kuò)增

ITS2引物為2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。將引物稀釋至2 μmol·μL-1，擴(kuò)增DNA模板。PCR體系為DNA模板2 μL、2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、引物2F/3R(2.5 μmol·L-1)各1.0 μL、ddH2O 8.5 μL，共25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，45 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃孵育10 min，純化后的PCR產(chǎn)物送至中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)序。

2.3 數(shù)據(jù)分析

利用CodonCode Aligner V 9.0.1(CodonCode Co.)軟件進(jìn)行序列校對(duì)、拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)?；陔[馬爾可夫模型(Hidden Markov model，HMM)去除5.8 S rRNA和28 S rRNA基因區(qū)。使用“中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)”(www.tcmbarcode.cn)和美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)功能完成人參花、西洋參花和三七花的物種鑒定。采用MEGA 7.0軟件對(duì)測(cè)序得到的ITS2序列和GenBank下載的人參屬ITS2序列進(jìn)行多序列比對(duì)。

3 結(jié)果

3.1 人參花、西洋參花和ITS2 2F/3R三七花SNP位點(diǎn)的篩選

所有樣品均采用ITS2 2F/3R引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增成功率為100%，ITS2序列大小為230 bp，具體信息見(jiàn)圖2，共獲得了22條ITS2序列。BLAST結(jié)果表明，所有市售樣品均為正品。采用MEGA 7.0將獲得的序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明，在19～47 bp處，存在人參花、西洋參花和三七花的穩(wěn)定遺傳變異。在該區(qū)間內(nèi)，人參特有的序列片段為5′-AACCCATCACTCCCTTGCGGGAGTTGAGG-3′，與人參相比，西洋參呈現(xiàn)2個(gè)變異位點(diǎn)[分別是32位胸腺嘧啶(T)和43位胞嘧啶(C)]，三七出現(xiàn)4個(gè)變異位點(diǎn)(分別是28位T、34位C、43位C和46位T)，見(jiàn)表2。

圖2 人參花、西洋參花和三七花的ITS2序列特征

表2 人參花、西洋參花和三七花ITS2區(qū)域5個(gè)穩(wěn)定的SNP位點(diǎn)

3.2 人參花、西洋參花和三七花ITS2數(shù)據(jù)庫(kù)的建立及SNP位點(diǎn)保守性評(píng)估

為了評(píng)價(jià)該區(qū)間在物種鑒定方面的準(zhǔn)確性和特異性，從GenBank下載了109條人參、西洋參和三七的ITS2序列，并采用MEGA 7.0進(jìn)行比對(duì)(圖3)。比對(duì)結(jié)果表明，在這28 bp內(nèi)，3個(gè)物種間存在穩(wěn)定的變異位點(diǎn)。其中，人參和西洋參存在2個(gè)變異位點(diǎn)，人參和三七存在4個(gè)變異位點(diǎn)，西洋參和三七存在4個(gè)變異位點(diǎn)。因此，在19～47 bp內(nèi)的SNP位點(diǎn)可應(yīng)用于人參花、西洋參花和三七花的物種鑒定。

3.3 基于SNP雙峰法的混合物檢測(cè)

將人參花和西洋參花、人參花和三七花、西洋參花和三七花粉末以2∶8、2∶10、8∶2和10∶2人工混合，混合物的DNA均采用ITS2 2F/3R引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增成功率為100%。以PCR產(chǎn)物的測(cè)序峰圖對(duì)混合粉末的物種組成進(jìn)行了檢測(cè)。

如圖4所示，人參的SNP位點(diǎn)(32、43 bp)處主峰為C/T(圖4A)，西洋參在該處的主峰為T/C(圖4B)，混合物僅在SNP位點(diǎn)出現(xiàn)雙峰(圖4C～F)。當(dāng)人參花和西洋參花以2∶8混合時(shí)，BLAST分析顯示該樣品為人參。此時(shí)，在32 bp處，西洋參花的主峰T略高于人參花的主峰C，在43 bp處，人參花的主峰T略高于西洋參花的主峰C(圖4C)，表明該樣品為人參花和西洋參花的混合物。當(dāng)人參花和西洋參花以2∶10混合時(shí)，BLAST分析顯示該樣品為西洋參。此時(shí)，西洋參花的主峰T/C高于人參花的主峰C/T(圖4D)，表明該樣品為摻雜有人參花的西洋參花。當(dāng)人參花和西洋參花以8∶2混合時(shí)，BLAST分析顯示該樣品為人參。此時(shí)，人參花的主峰C/T高于西洋參花的主峰C/T(圖4E)，表明該樣品為摻雜有少量西洋參花的人參花。當(dāng)人參花和西洋參花以10∶2混合時(shí)，BLAST結(jié)果顯示該樣品為人參。此時(shí)，人參花的主峰C/T遠(yuǎn)高于西洋參花的峰T/C(圖4F)，表明該樣品為摻雜有微量西洋參花的人參花。

圖3 人參、西洋參和三七的ITS2序列片段比對(duì)結(jié)果

注：A.人參花；B.西洋參花；C.人參花和西洋參花2∶8混合；D.人參花和西洋參花2∶10混合；E.人參花和西洋參花8∶2混合；F.人參花和西洋參花10∶2混合。圖4 人參花、西洋參花和兩花混合物雙峰圖

如圖5所示，人參的SNP位點(diǎn)(28、34、43、46 bp)處主峰為C/T/T/G(圖5A)，三七在該處的主峰為T/C/C/T(圖5B)，混合物僅在SNP位點(diǎn)處出現(xiàn)雙峰(圖5C～F)。當(dāng)人參花和三七花以2∶8混合時(shí)，BLAST分析顯示該樣品為三七。此時(shí)，在28、34、46 bp處，三七花的主峰T/C/T略高于人參花的主峰C/T/G，在43 bp處，人參花的主峰略高于三七花的主峰C(圖5C)，表明該樣品為摻雜有人參花的三七花。當(dāng)人參花和三七花以2∶10混合時(shí)，BLAST分析顯示該樣品為三七。此時(shí)，在28、34、46 bp處，三七花的主峰T/C/T高于人參花的主峰C/T/G，在43 bp處，人參花的主峰高于三七花的主峰C(圖5D)，表明該樣品為摻雜有少量人參花的三七花。當(dāng)人參花和三七花以8∶2混合時(shí)，BLAST分析顯示該樣品為人參。此時(shí)，人參花的主峰C/T/T/G高于三七花的主峰T/C/C/T(圖5E)，表明該樣品為摻雜有少量三七花的人參花。當(dāng)人參花和三七花以10∶2混合時(shí)，BLAST分析顯示該樣品為人參。此時(shí)，人參花的主峰C/T/T/G遠(yuǎn)高于三七的主峰T/C/C/T(圖5F)，表明該樣品為摻雜有微量三七花的人參花。

注：A.人參花；B.三七花；C.人參花和三七花2∶8混合；D.人參花和三七花2∶10混合；E.人參花和三七花8∶2混合；F.人參花和三七花10∶2混合。圖5 人參花、三七花和兩花混合物雙峰圖

如圖6所示，西洋參花在28、32、34、46 bp處主峰為C/T/T/G(圖6A)，三七花在該處的主峰為T/C/C/T(圖6B)，混合物僅在SNP位點(diǎn)處出現(xiàn)雙峰(圖6C～F)。當(dāng)西洋參花和三七花以2∶8混合時(shí)，BLAST分析顯示該樣品為三七，此時(shí)，三七花主峰T/C/C/T高于西洋參花的主峰C/T/C/G(圖6C)，表明該樣品為摻雜有少量西洋參花的三七花。當(dāng)西洋參花和三七花以2∶10混合時(shí)，BLAST分析顯示該樣品為三七。此時(shí)，在34 bp處，三七花主峰C遠(yuǎn)高于西洋參花的主峰T(圖6D)，表明該樣品為摻雜有微量西洋參花的三七花。當(dāng)西洋參花和三七花以8∶2混合時(shí)，BLAST分析顯示該樣品為西洋參。此時(shí)，在28、34、46 bp處，西洋參花的主峰C/T/G高于三七花的主峰/T/C/T，在32 bp處，三七花的主峰C高于西洋參花的主峰T(圖6E)，表明該樣品為摻雜有三七花的西洋參花。當(dāng)西洋參花和三七花以10∶2混合時(shí)，BLAST分析顯示該樣品為西洋參。此時(shí)，西洋參花的主峰C/T/T/G遠(yuǎn)高于三七花的主峰/T/C/C/T(圖6F)，表明該樣品為摻雜有少量三七花的西洋參花。

注：A.西洋參花；B.三七花；C.西洋參花和三七花2∶8混合；D.西洋參花和三七花2∶10混合；E.西洋參花和三七花8∶2混合；F.西洋參花和三七花10∶2混合。圖6 人參花、三七花和兩花混合物雙峰圖

3.4 基于SNP雙峰法對(duì)市售商品BLAST結(jié)果的深度驗(yàn)證

鑒于混合物的BLAST分析結(jié)果與實(shí)際結(jié)果存在差異，對(duì)采用BLAST分析的22份花類商品進(jìn)行了深度分析。峰圖顯示(圖7)，樣品S1和樣品S7在32、43 bp處出現(xiàn)雙峰，且T/C峰高于C/T峰，表明樣品1和樣品7為摻雜有少量人參花的西洋參花。此外，其余20份樣品在SNP處均為單峰，表明均為正品。

注：S6.正品西洋參花；S1、S7.摻雜有少量人參花的西洋參花。圖7 西洋參花樣品雙峰圖

4 討論

4.1 SNP雙峰法在花類混合物鑒定中的必要性

人參花、西洋參花和三七花不僅可以作為花茶飲用，同時(shí)也是很多保健品的原材料。但是，由于此3類物種的相似性和市場(chǎng)監(jiān)管的缺失，有必要開(kāi)發(fā)一種新的鑒別方法對(duì)該類產(chǎn)品市場(chǎng)進(jìn)行規(guī)范化的引導(dǎo)。

Chen等[12]發(fā)現(xiàn)，人參和西洋參的遺傳距離較小(0～0.02)，在其ITS2區(qū)域可以檢測(cè)出穩(wěn)定的SNP位點(diǎn)，認(rèn)為ITS2可應(yīng)用于人參和西洋參的鑒別。Liu等[14]報(bào)道了一種基于ITS2序列的西洋參專屬分子身份證，應(yīng)用該分子身份證不僅可實(shí)現(xiàn)西洋參與其混偽品的鑒別，還可實(shí)現(xiàn)深加工的中成藥鑒別。但是，目前對(duì)于該類產(chǎn)品多集中于混偽品的研究，缺乏對(duì)于混合物行之有效的鑒定方法?；谝陨蠗l形碼鑒定方法在物種鑒定上的準(zhǔn)確性，考慮將該方法引入到花類產(chǎn)品以及花類混合物的鑒定中。本研究中發(fā)現(xiàn)了可應(yīng)用于人參花、西洋參花和三七花物種鑒定的SNP位點(diǎn)，不僅可以準(zhǔn)確鑒定這3種花的真?zhèn)?，還可以對(duì)混合粉末的組成做出判斷。

4.2 SNP雙峰法是BLAST分析的補(bǔ)充手段

在本研究中，SNP雙峰法可準(zhǔn)確、迅速、直觀地對(duì)近緣物種進(jìn)行鑒定。通過(guò)人工混合不同比例的人參花和西洋參花、人參花和三七花、西洋參花和三七花來(lái)驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性。通過(guò)對(duì)混合物ITS2序列的BLAST分析法和SNP雙峰法的分析結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)SNP雙峰法是物種鑒定的靈敏手段。當(dāng)西洋參花和三七花以2∶8混合時(shí)，BLAST結(jié)果顯示該樣品為三七，此時(shí)，三七花主峰T/C/C/T高于西洋參花的主峰C/T/C/G，表明該樣品為摻雜有西洋參花的三七花。Gao等[15]發(fā)現(xiàn)，即使在混合比例低至6%時(shí)，通過(guò)分析SNP位點(diǎn)的雙峰仍可以清楚地檢測(cè)到金銀花和山銀花的混合物。同樣，在本研究中，通過(guò)分析SNP位點(diǎn)的雙峰，可以有效地鑒定人參花和西洋參花、人參花和三七花、西洋參花和三七花的混合物。

在此基礎(chǔ)上，對(duì)本研究中的22份商品花類進(jìn)行了深度鑒定。鑒定結(jié)果表明，22份商品中，20份商品為正品。BLAST分析結(jié)果表明，基于DNA條形碼序列判斷22份商品均為正品。而SNP雙峰法的驗(yàn)證結(jié)果顯示，所有的人參花和三七花均為正品，但9份西洋參花中有2份商品在SNP位點(diǎn)處出現(xiàn)雙峰，且西洋參花的主峰T/C高于人參花的主峰C/T，據(jù)此推斷這2份樣品為摻雜有少量人參花的西洋參花。因此，SNP雙峰法可以作為BLAST分析的補(bǔ)充手段，用于物種的鑒定。

4.3 SNP雙峰法為花類市場(chǎng)監(jiān)管提供有效的技術(shù)支撐

近年來(lái)，DNA條形碼技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中藥的物種鑒定(包括根類、種子類、葉類和花)[16-19]。這些結(jié)果表明，DNA條形碼是高效的物種鑒定工具。本研究在DNA條形碼的基礎(chǔ)上，成功利用SNP雙峰法對(duì)市售人參花、西洋參花和三七花進(jìn)行了鑒定，且實(shí)現(xiàn)了3種花類兩兩混合物的鑒定。因此，利用SNP雙峰法可實(shí)現(xiàn)人參花、西洋參花和三七花的鑒定，同時(shí)可為花類產(chǎn)品的檢測(cè)提供參考。