劉國棟，莊春林，余建強，石 英

（1.寧夏醫(yī)科大學藥學院，銀川 750004；2.第二軍醫(yī)大學藥學院，上海 200433）

多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）是一種中樞神經系統(tǒng)（central nervous system，CNS）退行性疾病，會導致大腦和脊髓白質中的局灶性炎癥性脫髓鞘，從而產生運動和認知功能障礙[1-2]。有證據表明MS的炎性反應與氧化應激密切相關，氧化應激反應通過氧化脂質、蛋白質和DNA等直接促進脫髓鞘，也間接地通過誘導免疫失調和炎性反應而導致脫髓鞘[3-4]。Keap1-Nrf2-抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）信號通路是一個綜合的氧化還原反應體系，激活該途徑對于維持細胞的氧化平衡至關重要。該通路在炎性反應中也起著關鍵作用，因此，清晰認識Keap1-Nrf2-ARE信號通路各部結構和功能及整體作用機制在MS研究過程中有著重要意義。

1 Keap1-Nrf2-ARE信號通路的結構

1.1 Nrf2

Nrf2是具有高度保守性的堿性亮氨酸拉鏈結構的轉錄因子（圖1）。人類的Nrf2由605個氨基酸組成，含有7個結構功能域，分別被命名為Neh1～Neh7，每個結構域對Nrf2的功能起著不同的作用[5]。Neh1是一個包含堿性亮氨酸拉鏈基序，可與細胞核內DNA、小肌腱膜纖維肉瘤蛋白（Maf）或其他轉錄因子形成異二聚體，從而再與ARE結合，啟動目標基因的轉錄。Neh2位于Nrf2的N端，含有多個可被泛素化修飾的賴氨酸殘基和兩個Keap1的結合位點（ETGE和DLG），這兩個基序對于Keap1和Nrf2之間調節(jié)Nrf2泛素化和穩(wěn)定性的相互作用至關重要[6]。Neh3位于C末端，通過與Nrf2轉錄輔助激活子染色質解螺旋酶DNA結合蛋白6結合活化轉錄。Neh4和Neh5是兩個獨立的轉錄結構域，當Nrf2進入細胞核并以Nrf2-Maf二聚形式與ARE結合后，并不能立即啟動轉錄，還需要cAMP反應元件結合蛋白與Neh4、Neh5兩個結構域結合，啟動轉錄過程。Neh6是一個富含絲氨酸殘基的結構域，對于Nrf2有獨立于Keap1的負性調控作用[7]。Wang等[8]在研究視黃醇受體α（RXRα）與Nrf2相互作用的時候發(fā)現Nrf2中未定義的氨基酸209-316區(qū)域，將其命名為Neh7結構域。

1.2 Keap1

Keap1是由624個氨基酸組成的蛋白質，負調控Nrf2的活性。人類的Keap1蛋白序列包含5個結構域，分別為N端區(qū)域（N-terminal region，NTR）、BTB區(qū)域（broad complex，tramtrack，and Bric-aBrac，BTB）、中間連接區(qū)域（linker intervening region，IVR）、DGR區(qū)域（double glycine repeat，DGR）及C端區(qū)域（C-terminal region，CTR），見圖1[9]。人類Keap1蛋白共包含27個半胱氨酸殘基（Cys），其中7個Cys（Cys151、Cys257、Cys273、Cys288、Cys297、Cys434和Cys613）對活性氧和親電試劑具有較高的活性，參與氧化還原信號傳導[6，10]。BTB結構域的主要功能是促進Keap1與Nrf2的二聚和Keap1與Cul3的相互作用。IVR結構域具有對氧化物或親電試劑高度敏感性的半胱氨酸殘基，可作為氧化應激的傳感器。DGR結構域包含6個雙甘氨酸重復序列，是Keap1與Nrf2的Neh2區(qū)連接的蛋白接觸位點。DGR和CTR域也被稱為DC結構域，它們與Nrf2的Neh2結合，介導Keap1和Nrf2之間的相互作用[6-7]。

1.3 ARE

ARE也被稱為親電效應元件，位于許多細胞保護基因啟動子的上游，調節(jié)具有細胞保護作用蛋白和Ⅱ相代謝酶基因的表達。在氧化應激的條件下，游離的Nrf2轉位進入細胞核，與小肌腱膜纖維肉瘤蛋白結合形成異二聚體，激活依賴ARE目的基因的表達，發(fā)揮抗氧化作用。研究表明，Nrf2與Bach1均可以與ARE結合，啟動Ⅱ相代謝酶和抗氧化基因的表達，從而保護機體組織細胞的正常功能[11-12]。

1.4 Keap1-Nrf2-ARE信號通路的活化

在正常的生理狀態(tài)下，Keap1通過其BTB結構域形成一個同二聚體，然后與細胞質中Nrf2的DC結構域結合，通過泛素化-蛋白酶體途徑使Nrf2降解。而當機體受到親電試劑刺激或處于氧化應激狀態(tài)時，Keap1的半胱氨酸殘基被共價修飾，導致其構象發(fā)生改變，與Nrf2解離，從而避免了Nrf2被泛素化和降解。累積的Nrf2進入細胞核與ARE結合，從而啟動下游一系列保護基因的表達，如NADPH醌氧化還原酶-1（NADPH：quinone oxidoreductase-1，NQO-1）、血紅素加氧酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）、谷胱甘肽-S-轉移酶（glutathione-S-transferase，GST）等，見圖2。研究顯示，Nrf2信號通路調控600多個基因，其中200多個編碼與炎癥、神經退行性疾病和其他慢性疾病相關的蛋白質[13]。

2 Nrf2激活劑

激活Nrf2的方式主要有共價和非共價修飾兩類。共價修飾是通過配體親電性基團與Keap1中的硫醇等隨機反應結合，其反應性比較難控制，與目標靶點的結合缺乏特異性，從而降低其調控作用，最終導致一些不必要的脫靶毒性效應。非共價修飾是通過直接阻斷Keap1與Nrf2之間的相互作用，進而使Nrf2從復合物中解離，發(fā)揮激活Nrf2的作用。非共價修飾克服了共價Nrf2激活劑的脫靶問題，避免了不確定的毒副作用[10，14]。兩者作用機制見圖3。

圖1 Keap1和Nrf2結構區(qū)域

2.1 Nrf2親電激活劑

由圖4可見，富馬酸二甲酯（Dimethyl Fumarate，DMF）為化合物1，是一個成功的Nrf2激活劑，已被FDA批準用于治療復發(fā)型多發(fā)性硬化癥[14]。藥代動力學研究表明，DMF是一種在體內迅速轉化為富馬酸單乙酯的前藥，與Keap1的Cys151殘基共價反應，導致Nrf2介導的腦神經元和神經膠質細胞基因反式激活。然而DMF的臨床應用會產生一些不良反應，如輕度至中度腹痛、腹瀉、惡心和嚴重白細胞減少等癥狀[15]。巴多索?。˙arduxolone，CDDO）是另一個Nrf2親電激活劑，它與Keap1的Cys151殘基發(fā)生共價可逆反應。但CDDO甲基化修飾的產物——甲基巴多索?。˙arduxolone methyl，CDDO-Me）為化合物2，因增加了糖尿病患者心力衰竭的風險，未能通過腎臟治療的Ⅲ期臨床試驗[16]。CDDO-Me目前正在肺動脈高壓疾病的臨床試驗中進行研究[15]。蘿卜硫素為化合物3，是西蘭花芽中提取的異硫氰酸酯化合物，在一些臨床研究中也得到了評價[14，17]。

圖2 Keap1-Nrf2-ARE信號通路活化機制

圖3 不同Nrf2激活劑的作用機制

圖4 Nrf2親電激活劑

圖5 四氫異喹啉類結構優(yōu)化

2.2 Nrf2非共價激活劑

在已開發(fā)非共價激活劑的設計和優(yōu)化過程中運用了一些經典的藥物化學策略，如基于結構的藥物設計和優(yōu)化策略、基于生物電子等排原理、基于片段的藥物設計策略和基于骨架躍遷的藥物優(yōu)化策略等，從而使目標化合物靶點親和力和蛋白-蛋白相互作用抑制活性普遍得到提升，同時使理化性質更有助于化合物成藥。同時，進一步通過有效地激活Nrf2對于MS的研究具有廣闊的應用前景，加快了MS治療藥物的研發(fā)進程。

2.2.1 基于結構的藥物設計和優(yōu)化策略 Hu等[18]首次報道了1，2，3，4-四氫異喹啉類的小分子Keap1-Nrf2抑制劑（圖5）。圖5中化合物4通過高通量篩選得到，通過熒光偏振（fluorescence polarization，FP）測定法測定其對Keap1-Kelch結構域與Nrf2衍生肽之間相互作用的抑制活性（IC50=2.3μM）。通過表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）測得其對靶點的親和力值Kd=1.0μM。然后在化合物4的基礎上，利用生物電子等排體原理將羧酸用四氮唑取代，得到化合物5，其對Keap1-Nrf2抑制活性降低了約3倍（IC50=7.4μM）；然而當去除鄰苯二甲酰亞胺的羰基得到化合物6，其對Keap1-Nrf2抑制活性提高約2倍（IC50=1.1μM）；在5位引入甲基得到化合物7，其對蛋白相互作用抑制活性進一步提升（IC50=750 nM）[19]。

2.2.2 基于生物電子等排的優(yōu)化策略 Marcotte等[20]通過篩選267551個化合物得到以1，4二氨基萘為母核的Keap1-Nrf2抑制劑化合物8，其對蛋白相互作用的抑制活性為IC50=1.46μM；Jiang等[21]在化合物8的基礎上進行了進一步結構優(yōu)化，在化合物8的磺酰胺基的氮上引入亞甲基羧酸得到化合物9。化合物9是更有效的Keap1-Nrf2抑制劑，相對于化合物8抑制活性提高了約200倍以上（IC50=28.6 nM），并且靶點親和力也大大提高（Kd=3.59 nM）；為了改善化合物9的類藥性，利用對乙酰氨基取代對甲氧基得到化合物10，其對蛋白相互作用的抑制活性進一步提升（IC50=14.4 nM）[22]；Lu等[23]利用生物電子等排原理將羧酸用四氮唑取代，得到化合物11，使其在保持原抑制活性的基礎上透膜性大大提升（Pe=42.266±4.476），見圖6。

2.2.3 基于片段的藥物設計策略 2016年，Astex制藥公司和葛蘭素史克制藥公司通過基于片段的藥物設計方法報道了一種新型苯丙酸類Keap1-Nrf2抑制劑[24]。通過利用X射線晶體衍射篩選出大約330個片段，鑒定出分別與關鍵氨基酸殘基Arg483、Tyr525和Ser602相互作用的A、B、C片段，盡管片段A對蛋白相互作用抑制活性＞1 mM，但仍被確定為細化的“錨片段”。在片段生長過程中，苯丙三唑部分直接連接到片段A的芐位，從而得到了化合物12（IC50=61μM）（圖7）。在化合物12氯苯的3位引入烷基苯磺酰胺，由于苯磺酰胺可以與Tyr334通過π-π堆積相互作用，進而使活性進一步提升，得到化合物13（IC50=0.27μM），見圖7。最后，為了使目標分子能夠以穩(wěn)定構象與靶點結合，通過苯磺酰胺的環(huán)化反應，形成了一個融合的7元雜環(huán)，得到活性進一步提升的化合物14（圖7）[6，16]。研究表明，化合物14可以激活慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者支氣管上皮細胞中的Nrf2通路，從而誘導靶基因表達，提高抗氧化活性，減輕炎性反應。同時發(fā)現，化合物14可以激活COPD大鼠模型中的Nrf2，使得肺組織中炎癥程度降低[24]。

2.2.4 基于骨架躍遷的結構優(yōu)化策略 由圖8可見，化合物15為已報道的非共價Keap1-Nrf2抑制劑，其蛋白相互作用抑制活性為0.11μM（圖8）。但是萘環(huán)1、4位上兩個氮原子會引起代謝穩(wěn)定性問題[25]。Abed等基于骨架躍遷策略將化合物15的萘環(huán)減化為一個苯環(huán)，得到1，2-二取代二甲苯類似物16[26]，其代謝穩(wěn)定性雖然增加，但抑制活性降低。通過在化合物16羧酸α碳上引入甲基，得到了抑制活性提高約15倍的手性化合物17（IC50=0.15μM）。同樣化合物19也是基于骨架躍遷策略減化化合物18中一個苯環(huán)得到的4-苯基-1，2，4三唑母核Keap1-Nrf2抑制劑，化合物19的硝基通過與關鍵氨基酸殘基Arg483相互作用，有效激活Nrf2-ARE通路，同時其對靶點親和力也進一步提升（Kd=16.5μM）[16]。

圖6 1，4-二氨基萘類結構優(yōu)化

3 MS治療藥物現狀

MS的藥物治療始于20世紀90年代，干擾素β和醋酸格拉替雷是1993年批準的第一批治療MS注射制劑，兩者主要用于治療復發(fā)緩解型多發(fā)性硬化癥。10年后，第一種單克隆抗體那他珠單抗獲得批準，它是一種人源化的單克隆抗體，可防止淋巴細胞穿過血腦屏障[27]。芬戈莫德，特立氟胺和富馬酸二甲酯是在2010至2020年上市的三個口服藥物，其中芬戈莫德于2018年5月被FDA批準用于治療10~25歲的青少年患者[28-30]。研究表明，自20世紀90年代以來，全球MS患病率急劇上升。目前，全球有250多萬的MS患者，其中80%被確診為復發(fā)緩解型，這相比于1990年患病率增加了10.4%[2，31]。國內外首推的MS黃金治療方法是疾病修飾治療（disease-modifying treatments，DMT）。同時根據中國《多發(fā)性硬化患者生存報告（2019）》可知，國內多發(fā)性硬化癥患者3萬～5萬人，83%為復發(fā)緩解型，臨床上接受DMT治療的僅有10%，仍有90%的患者因為副作用和間斷性用藥導致復發(fā)等各種原因而處于無藥可用的狀態(tài)，因此，急需一種新的治療手段和策略。

圖7 苯丙酸類的藥物設計

圖8 1，2-二取代二甲苯類似物結構設計

4 激活Nrf2能夠有效緩解MS

目前，MS仍不能被徹底治愈，急需尋找和開發(fā)新的治療途徑。相關研究表明，激活Nrf2能夠調控免疫炎性反應、鐵代謝、線粒體功能、自噬等方面，進而緩解MS患者和動物模型的臨床癥狀。

4.1 CNS的炎癥調節(jié)

在經典MS模型——實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimentally induced autoimmune encephalomyelitis，EAE）模型中研究發(fā)現，DMF作為Nrf2激活劑，可顯著緩解脫髓鞘和認知功能障礙等臨床癥狀[32-33]。在MS的病理過程研究中發(fā)現，高促炎性自身反應T細胞入侵到中樞神經系統(tǒng)，產生干擾素γ和白細胞介素17A導致炎性反應[4]。同時，增加了血腦屏障的通透性，并促使其他免疫細胞進入中樞神經系統(tǒng)[4，34]。該過程伴隨著巨噬細胞/小膠質細胞的持續(xù)激活，并釋放促炎細胞因子和趨化因子，使炎性反應加劇[35-36]。研究發(fā)現，在MS患者和EAE動物模型中，Nrf2低表達且HO-1缺乏時，導致EAE小鼠模型脫髓鞘加劇和患者病情惡化[37-38]。而當激活Nrf2時，下游白細胞介素17以及炎癥因子Th1和Th17的產生受到抑制，同時使下游HO-1高表達，從而抑制促炎細胞因子和趨化因子的過度分泌，最終緩解炎性反應[39-40]。

4.2 鐵代謝

腦內鐵代謝失調是MS疾病過程中導致氧化應激的重要因素之一[41-42]。在健康的成人腦中，鐵主要儲存在少突膠質細胞中。而在MS患者腦中的巨噬細胞和小膠質細胞鐵含量也是增加的，這些過量的鐵在髓鞘降解和清除的過程中會被釋放到細胞外，隨后轉化為二價亞鐵形式，通過Fenton反應生成活性氧進一步對機體造成損傷[43]。另外，巨噬細胞中鐵的含量過高也會促使炎癥的發(fā)生[44]。在EAE模型中，腦中鐵過量會導致參與磷脂和髓鞘代謝的幾個相關蛋白表達降低，可能會影響髓鞘的合成和恢復[45]。激活Nrf2可以調節(jié)鐵代謝中的鐵蛋白及相關酶來維持體內鐵平衡，降低脫髓鞘程度，進而緩解MS的臨床癥狀和疾病復發(fā)[46]。

4.3 線粒體功能

越來越多的證據表明，線粒體功能障礙也是MS發(fā)病和復發(fā)的重要因素之一[47-48]。通過對MS患者大腦軸突研究發(fā)現，線粒體功能障礙和ATP缺乏，會導致動作電位在傳導過程中無法將Na+從軸漿轉移到細胞外[49-50]，這會導致反向Na+-Ca2+交換體的激活，造成軸漿內Ca2+濃度升高，最終引起Ca2+介導的中樞神經系統(tǒng)炎癥，并伴隨能量失衡和脫髓鞘[51-52]。通過對分離線粒體和培養(yǎng)細胞的研究表明，Nrf2缺乏可導致線粒體脂肪酸氧化、呼吸和ATP生成等過程受阻[53-54]。同時研究發(fā)現MS患者中過氧化物酶體增殖物激活受體γ-輔助活化因子-1α（peroxisome proliferatoractivated receptor gamma coactivator 1 alpha，PGC-1α）的表達降低會導致線粒體功能障礙，從而促進復發(fā)，加快病情進展[55-56]。Nrf2也被報道通過激活PGC-1α和核呼吸因子1來維持線粒體正常的能量代謝功能[57]。因此，通過激活Nrf2來維持MS患者體內線粒體功能穩(wěn)態(tài)，對于緩解MS相關臨床癥狀具有十分重要的意義。

4.4 自噬

研究顯示，自噬降解途徑受阻會導致MS細胞外纖維連接蛋白的聚集，進而影響再髓鞘化過程[58]。MS患者由于自噬水平的降低，在大腦和腦脊液中均檢測到可溶性低聚物以及在EAE模型中也檢測到氧化蛋白聚集體增加，進而加劇炎性反應[59-61]。研究表明，在EAE模型中，Nrf2缺乏導致自噬降解途徑降低，而通過激活Nrf2可誘導自噬相關基因的表達，進而促進自噬，緩解脫髓鞘和炎性反應[62]。

非共價小分子Keap1-Nrf2抑制劑由于分子量較大，且含有大極性親水性基團難以透過血腦屏障進入中樞神經。為了克服這種局限性，可以通過生物電子等排等結構優(yōu)化策略，使目標分子保持原活性的基礎上具有更強的血腦屏障透過能力。此外，在既患有癌癥又患有MS的患者治療過程中，Nrf2激活劑會增加腫瘤轉移的風險，這也取決于疾病的背景和階段[63，64]。因此，在使用Nrf2激活劑藥物治療該類患者時，要評估此類藥物的風險。

5 總結和展望

MS是一種發(fā)病機制復雜的多因素疾病，目前研究的藥物雖尚不能徹底治愈，但通過調控Keap1-Nrf2-ARE信號通路，能夠有效緩解MS的復發(fā)和臨床癥狀。其中激活Nrf2能夠使MS患者及動物模型中的免疫炎性反應、鐵代謝、自噬等生理過程介導的臨床癥狀得到改善。大多數Nrf2親電激活劑由于反應性比較難控制，與目標靶點的結合缺乏特異性，最終導致一些不必要的脫靶毒性效應。而非共價小分子Nrf2激活劑通過阻斷Keap1和Nrf2之間的相互作用克服了親電性Nrf2激活劑的缺點，非共價Nrf2激活劑在MS的研究中具有良好的應用前景，未來很有可能會用于MS的臨床治療。同時，結合國內的MS治療情況，增加對Keap1-Nrf2-ARE信號通路在MS過程中所起作用的認識，有助于新型MS治療藥物的研發(fā)。