鎖志剛，丁惠強，費 樂，黑 龍，戈朝暉，馬宗軍，陳霄雷

（寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院脊柱骨科，銀川 750004）

脊髓損傷可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性損傷是可逆的，在脊髓損傷的治療中占主導作用。研究證實[1]，Caspase-1抑制劑是Caspase-1不可逆和可滲透細胞的特異抑制劑。本研究采用改良的Allen's重物打擊法建立大鼠脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）模型，通過HE染色、免疫組織化學法檢測觀察Caspase-1抑制劑在SCI后對大鼠Caspase-1、白細胞介素（IL）-1β和IL-18表達的抑制作用，以期為繼發(fā)性脊髓損害后靶點抑制作用提供新的實驗基礎。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與分組

成年雄性SD大鼠72只（由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供），體質量250～300 g，隨機分為對照組、SCI組、AC.YVAD.CMK組、甲基強的松龍（methyl prednisolone，MP）組，每組18只，SCI組、AC.YVAD.CMK組及MP組大鼠均應用改良的Allen's重物打擊法建立大鼠脊髓損傷模型，正常對照組大鼠只做全椎板切除。4組大鼠依據損傷后取材時間（分別于術后24 h、72 h、7 d處死）再各分3個亞組，每個亞組6只。

1.2 主要試劑

Caspase-1抑制劑：AC.YVAD.CMK購自MC公司；二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒購自Tiangen公司；甲基強的松龍購自PfizerMamu facturingBelgiumNV公司；兔抗大鼠Caspase-1多克隆抗體、兔抗大鼠IL-l8多克隆抗體、IL-1β多克隆抗體、過氧化物酶標記的鏈霉卵白素染色試劑盒均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 大鼠脊髓損傷模型制作及各組給藥

大鼠實驗前常規(guī)禁食8 h，實驗順序隨機。選用30 g·L-1的戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，將大鼠固定于手術臺，常規(guī)背部剃毛、消毒鋪巾。無菌條件下取腰背部正中切口，逐層分開顯露T8～T10椎板，行T9全椎板切除，顯露硬脊膜并使之保持完整，鉗夾固定T8及T10棘突，用直徑2.5 mm、質量10.0 g的不銹鋼棒沿帶有刻度的玻璃導管從25 mm高處垂直下落，打擊在由塑料材料制成的底部呈凹面、直徑為3 mm的撞桿上，造成大鼠脊髓不完全損傷致傷后迅速移開打擊物，0號線逐層縫合切口。

模型成功的判定標準：打擊后，損傷處脊髓出血、水腫，大鼠出現擺尾反射，雙下肢及軀體回縮樣撲動，麻醉清醒后雙下肢呈弛緩性癱瘓。造模成功后，AC.YVAD.CMK組大鼠經腹腔內開始給藥，藥物為AC.YVAD.CMK，濃度為0.3 mg/100 g，早晚各1次，連續(xù)3 d，MP組大鼠經腹腔內開始給藥，藥物為甲基強的松龍，濃度為30 mg·kg-1，早晚各1次，連續(xù)3 d，SCI組及對照組大鼠依據術中出血量的多少即刻腹腔內注射等量的5%葡萄糖鹽水，以補充血容量。所有大鼠均給予青霉素鈉鹽500000 IU背外側肌群肌注預防感染，每天1次，持續(xù)3 d。大鼠注意保溫，分籠飼養(yǎng)，自由取食。每天早8：00及晚8：00行膀胱按摩協助排尿，直至建立反射性排空。

1.4 取材、切片制備

分別于術后24 h、72 h、7 d取各組大鼠6只，將大鼠過量麻醉，經左心室-升主動脈插管，快速灌注冰生理鹽水（4℃）沖洗，待流出的液體清亮后，灌注4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定45 min，自背部原切口顯露脊髓，以損傷處為中心，切取長約2.0 cm脊髓組織，放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液12～24 h，然后手工脫水，石蠟包埋（冠狀面切成長約3 mm的多個節(jié)段包埋于同一蠟塊中），行冠狀面連續(xù)切片，每個組織塊連續(xù)切片8張，片厚4μm。

1.5 HE染色及Caspase-1、IL-1β及IL-18免疫組化染色

每個時間點每只大鼠隨機選取2張切片進行HE染色，以損傷嚴重段脊髓取視野，光鏡下觀察脊髓組織形態(tài)學變化。每個時間點每只大鼠隨機選取2張切片分別進行Caspase-1、IL-1β及IL-18免疫組化染色。免疫組化染色按試劑盒說明書操作，一抗Caspase-1的工作濃度為1∶300，一抗IL-1β的工作濃度為1∶200，一抗IL-18的工作濃度為1∶500，最后用DAB顯色，鏡下觀察顯色背景，蒸餾水清洗終止顯色，蘇木素輕度復染，梯度脫水，透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。細胞內出現棕黃色顆粒為染色陽性細胞，每例切片雙盲法計數，在400倍鏡下，隨機觀察計數6個視野，記錄陽性細胞數，陽性表達率=6個視野內陽性細胞總數/6個視野內細胞總數×100%。

1.6 統計學方法

數據采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，三組大鼠脊髓組織中Caspase-1、IL-1β及IL-18陽性表達率的比較采用行×列表的卡方檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠脊髓損傷組織形態(tài)學變化

對照組HE染色大鼠神經元細胞結構形態(tài)規(guī)則，白質致密。AC.YVAD.CMK組大鼠24 h時鏡下主要表現為損傷局部可見出血灶，神經元細胞腫脹，但大多數細胞結構完整，可見少量神經元細胞結構變形死亡，周圍可見少量炎性細胞，以中性粒細胞為主；72 h時主要表現為出血灶大部分吸收，損傷周圍可見大量炎性細胞浸潤，以中性粒細胞為主，神經元細胞結構變形壞死較24 h明顯，灰質結構破壞，細胞空泡變性壞死，出現大量神經元細胞死亡。存活的神經元細胞中部分可見細胞膜破裂及核固縮；7 d時神經元細胞數量較前明顯減少，可見膠質細胞增生，炎性細胞也較前明顯減少，并出現少量淋巴細胞浸潤。

2.2 大鼠脊髓組織中Caspase-1表達情況

Caspase-1陽性表達定位于細胞胞漿，染色后為棕黃色顆粒。對照組有少量陽性細胞表達，AC.YVAD.CMK組24 h時Caspase-1陽性表達較SCI組少（圖1A），72 h時Caspase-1陽性細胞減少，損傷周圍可見大量炎性細胞（圖1B），7 d時有少量Caspase-1陽性細胞表達（圖1C）。

在脊髓損傷后24 h、72 h和7 d時，SCI組Caspase-1陽性表達率均高于對照組，AC.YVAD.CMK組Caspase-1陽性表達率均低于SCI組（P均＜0.01）。24 h和72 h時，AC.YVAD.CMK組Caspase-1陽性表達率低于MP組（P＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠脊髓組織中Caspase-1陽性表達率比較（%）

圖1 各組大鼠脊髓組織中Caspase-1、IL-1β和IL-18的陽性表達情況（免疫組化×400）

2.3 大鼠脊髓組織中IL-1β的表達情況

IL-1β陽性表達定位于胞漿，染色后為棕黃色顆粒。對照組大鼠脊髓組織中有少量細胞表達陽性；MP組24 h時，鏡下可見IL-1β陽性細胞少于AC.YVAD.CMK組（圖1D）；72 h、7 d時，IL-1β陽性細胞數明顯減少（圖1E、圖1F）。

在脊髓損傷后24 h、72 h和7 d時，SCI組IL-1β陽性表達率均高于對照組，AC.YVAD.CMK組和MP組IL-1β陽性表達率均低于SCI組（P均＜0.01）；24 h和72 h時，MP組IL-1β陽性表達率均低于AC.YVAD.CMK組（P均＜0.01），見表2。

2.4 大鼠脊髓組織中IL-18的表達情況

IL-18陽性表達定位于細胞胞漿，染色后呈棕黃色顆粒。對照組大鼠脊髓組織中有少量細胞表達陽性；SCI組24 h時鏡下IL-18陽性細胞數較對照組多（圖1H）；72 h時IL-18陽性細胞的表達達到峰值，損傷周圍可見大量炎性細胞（圖1I）；7 d時SCI組IL-18陽性細胞數明顯減少仍較對照組多（圖1J）。

在脊髓損傷后24 h、72 h和7 d時，SCI組IL-18陽性表達率均高于對照組，AC.YVAD.CM組和MP組IL-18陽性表達率均低于SCI組（均＜0.01），24 h和72 h時，AC.YVAD.CMK組IL 18陽性表達率低于MP組（P均＜0.05），見表3。

表2 各組大鼠脊髓組織中IL-1β陽性表達率比較（%）

3 討論

脊髓損傷是多因素參與的復雜過程，其病理機制仍不完全明確。研究表明[2]，損傷后炎性反應在脊髓損傷中起重要的作用，可導致細胞的壞死及凋亡，從而加重神經功能。Caspase-1又稱IL 1β轉化酶（interleukin-1betacoveratingenzymeICE）[3]，是Caspase超家族的重要成員，被認為主要參與機體的炎性反應，在組織損傷過程中催化生成有活性的細胞因子IL-1β和IL-18，有促炎性反應及級聯放大效應。已有研究[4]證實Caspase-1、IL-1β及IL-18在脊髓損傷后表達增高，參與脊髓損傷后炎性反應。

表3 各組大鼠脊髓組織中IL-18陽性表達率比較（%）

研究證實[5-6]，MP在脊髓損傷治療中發(fā)揮重要的作用，其主要作用包括抑制炎性反應，能夠抑制炎癥和炎性物質釋放，對脊髓損傷后神經功能恢復有促進作用，是目前臨床上治療脊髓損傷的首選藥物。研究發(fā)現[7]，脊髓損傷早期使用高劑量MP沖擊療法治療脊髓損傷是有效的。黃星球等[8]研究表明，大劑量MP沖擊治療可明顯改善微環(huán)境，通過對神經元細胞內尼氏體染色，證實MP可改善脊髓損傷后神經元形態(tài)，促進神經元恢復。本研究結果表明，大劑量MP組炎性細胞相對減少，神經元細胞結構與SCI組、AC.YVAD.CMK組無明顯差別。對于大劑量MP在脊髓損傷后抑制炎性反應的分子機制尚不完全清楚。本實驗研究也證實在脊髓損傷后給予大劑量MP治療，可抑制損傷后Caspase-1、IL-1β及IL-18的表達，特別是IL-1β的陽性表達。臨床上大劑量使用MP的并發(fā)癥有加重感染、誘發(fā)消化道出血及穿孔、導致股骨頭壞死等。如何減少相關并發(fā)癥的發(fā)生，是否能減少MP的使用量或者使用時間以及有無替代治療方法，是目前臨床關注的主要問題。

Caspase-1抑制劑可直接抑制Caspase-1的活性，阻礙其介導炎性反應的分子信號通路。關于Caspase-1抑制劑的研究多集中在中樞神經系統腦損傷方面[9-10]。研究發(fā)現[11]，Caspase-1抑制劑在腦損傷及腦膿腫動物模型中有顯著療效，能減輕腦水腫，對腦缺血后神經元具有保護及促進修復作用，還能促進炎性反應的進展。本研究表明，AC.YVAD.CMK組在HE染色光鏡下可見，損傷脊髓組織中炎性細胞的陽性細胞表達相對減少，提示Caspase-1抑制劑可以減輕脊髓損傷后炎性反應，減輕組織水腫。應用AC.YVAD.CMK后可減輕缺血組織的損傷程度，抑制神經元凋亡，改善神經功能，減輕腦水腫，推測AC.YVAD.CMK是通過抑制IL-1β而減輕腦水腫[12]。本研究表明，在應用AC.YVAD.CMK后，Caspase-1的陽性表達較MP組及SCI組降低，提示Caspase-1抑制劑在脊髓損傷后對Caspase-1有特異性抑制作用。AC.YVAD.CMK組及MP組IL-1β及IL-18的陽性表達均低于SCI組，提示Caspase-1抑制劑可以有效抑制細胞因子IL-1β和IL-18的表達，也進一步證實IL-1β和IL-18是Caspase-1特異有效的蛋白酶。在組織損傷過程中，通過催化生成有活性的細胞因子IL-1β和IL-18，是導致炎癥進一步發(fā)揮致炎促損傷的原因。損傷后7 d，AC.YVAD.CMK及MP組的Caspase-1、IL-1和IL-18與對照組比較差異均無統計學意義，提示Caspase-1抑制劑阻斷了炎性反應的進程，減輕了脊髓損傷組織水腫，為促進神經功能恢復提供了微環(huán)境。

綜上，Caspase-1抑制劑及MP均可以減輕損傷后脊髓組織中炎性細胞的表達，降低脊髓損傷后Caspase-1、IL-1β及IL-18的陽性表達。Caspase-1抑制劑可能對SCI后的繼發(fā)性損傷有一定的靶向抑制作用，可促進脊髓損傷后神經功能恢復。