展暉，侯夏寶，趙冰

新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院胸部腫瘤外科，河南 新鄉(xiāng) 453000

隨著人們生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，中國(guó)食管癌的發(fā)病率和病死率均較高。在中國(guó)，鱗狀細(xì)胞癌是食管癌的常見(jiàn)類(lèi)型，早期癥狀不典型，不易被發(fā)現(xiàn)，一旦確診常已發(fā)展為晚期，患者5年生存率低于10%。因此，進(jìn)一步探究食管癌的發(fā)病機(jī)制能夠提高食管癌的早期診斷率，降低病死率，改善預(yù)后。八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（octamer binding transcription factor 4，Oct4）是POU轉(zhuǎn)錄因子家族中的重要成員，定位于人類(lèi)染色體6p21.3，能夠通過(guò)結(jié)合于目的基因的Oct結(jié)構(gòu)域，抑制或激活下游靶基因。Oct4對(duì)于維持胚胎干細(xì)胞的多潛能性及自我更新具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，Oct4在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，包括食管癌，但具體作用機(jī)制未知，因此，本研究對(duì)Oct4在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲、遷移中的作用及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、試劑與儀器

食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Eca109購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、基質(zhì)金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、上皮鈣黏素（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、Twist及GAPDH多克隆抗體均購(gòu)于美國(guó)Cell Signal Technology公司；Opti-MEM培養(yǎng)基、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（H+L）、CCK-8試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒均購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購(gòu)于美國(guó)Gbico公司；Oct4對(duì)照和Oct4 shRNA均購(gòu)于上海吉瑪生物制藥技術(shù)有限公司；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒、Transwell小室均購(gòu)于美國(guó)Corning公司。TE2000熒光倒置顯微鏡購(gòu)于日本Nikon公司；迷你雙垂直電泳儀、迷你轉(zhuǎn)印電泳儀均購(gòu)于北京六一儀器廠；ChemiDocXRS凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于廣州銳博生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 室溫條件下，Opti-MEM培養(yǎng)基分別與Lipofectamine3000、Oct4對(duì)照及Oct4 shRNA稀釋混勻，再將稀釋好的Lipofectamine3000分別與稀釋好的Oct4對(duì)照、Oct4 shRNA混勻，并室溫下放置30 min，使其形成復(fù)合物。然后將復(fù)合物加入融合度為70%的Eca109細(xì)胞中，培養(yǎng)6 h，換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)至48 h。將Oct4對(duì)照及Oct4 shRNA轉(zhuǎn)染至食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Eca109中，分別記為對(duì)照組和干擾組。轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.2 實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)Oct4mRNA的相對(duì)表達(dá)量轉(zhuǎn)染并收集細(xì)胞，根據(jù)Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，DEPC水溶解RNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度及濃度，根據(jù)光密度（optical density，OD）值評(píng)估RNA純度，當(dāng)RNA純度良好（OD/OD=1.8）時(shí)，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：30℃6 min，40℃20 min。最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，15 min；變性95 ℃，20 s；退火60 ℃，34 s；共40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用2法計(jì)算Oct4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)Eca109細(xì)胞的活力 參照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)Eca109細(xì)胞的增殖活力，將5×10個(gè)Eca109細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%左右，轉(zhuǎn)染48 h后，在待測(cè)的每孔細(xì)胞中加入CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，于酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定各孔細(xì)胞的吸光度（A）值。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力 將5×10個(gè)轉(zhuǎn)染后的Eca109細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到100%時(shí)，用槍頭垂直于孔板進(jìn)行劃痕。磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞，于0 h拍照。將劃痕的培養(yǎng)板置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后再次給每個(gè)孔的劃痕進(jìn)行拍照，拍照位置與0 h的位置（定點(diǎn)）重合，即兩次時(shí)間點(diǎn)所拍照的劃痕為同一個(gè)位置的劃痕。使用24 h劃痕數(shù)據(jù)與0 h劃痕數(shù)據(jù)求出對(duì)應(yīng)的劃痕寬度，進(jìn)而計(jì)算出細(xì)胞的遷移速率。遷移速率=遷移距離（μm）/遷移時(shí)間（h）×100%。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力 將Matrigel膠平鋪于Transwell小室的微孔濾膜上，將1×10個(gè)Eca109細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞匯合度達(dá)到50%左右后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化并接種至Transwell上室，Transwell下室中僅含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，孵育48 h后，取出Transwell小室，用多聚甲醛固定后，對(duì)下室進(jìn)行結(jié)晶紫染色，于倒置顯微鏡下隨機(jī)觀察并統(tǒng)計(jì)下室5個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)目，取平均值，即為細(xì)胞的侵襲數(shù)目。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)細(xì)胞中蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞，收集上清液。使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，取30 μg蛋白樣品上樣，采用12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，將凝膠蛋白低溫下轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上封閉 40 min。加入2%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），室溫下孵育1 h。滴加兔抗MMP2、MMP9、E-cadherin、vimentin、Twist及GAPDH多克隆抗體溶液，4℃孵育過(guò)夜。第2天室溫孵育二抗，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光各蛋白條帶，并分析條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Oct4mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后，干擾組Eca109細(xì)胞中Oct4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（0.23±0.02），明顯低于對(duì)照組的（1.21±0.12），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.853，P＜0.01）。

2.2 細(xì)胞活力及遷移、侵襲能力的比較

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，干擾組Eca109細(xì)胞的活力為（0.38±0.03）%，明顯低于對(duì)照組的（0.48±0.04）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.451，P＜0.01）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，遷移24 h后，干擾組Eca109細(xì)胞的遷移速率為（4.32±0.43）%，明顯低于對(duì)照組的（42.36±4.24）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.920，P＜0.01）。Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，干擾組Eca109細(xì)胞的侵襲數(shù)目為（48.35±4.83）個(gè)，明顯少于對(duì)照組的（158.32±14.33）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=32.904，P＜0.01）（圖1）。

圖1 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲能力（結(jié)晶紫染色，×200）

2.3 Eca109細(xì)胞中MMP2、MMP9、E-cadherin、vimentin、Twist 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，干擾組Eca109細(xì)胞中MMP2、MMP9、vimentin、Twist蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組，E-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（圖2、表1）

圖2 Western blot 檢測(cè)兩組食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中MMP2、MMP9、E-cadherin、vimentin、Twist 蛋白表達(dá)情況

表1 兩組食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Eca109中MMP2、MMP9、E-cadherin、vimentin、Twist蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

3 討論

Oct4是一種由Pou5F1基因編碼的轉(zhuǎn)錄子，位于細(xì)胞核內(nèi)，其水平的高低決定干細(xì)胞在胚胎發(fā)育過(guò)程中的分化狀態(tài)，能使干細(xì)胞保持自我更新的狀態(tài)。研究顯示，Oct4在生殖細(xì)胞腫瘤（卵巢無(wú)性細(xì)胞瘤、睪丸生殖細(xì)胞瘤）和非生殖細(xì)胞腫瘤中呈高表達(dá)，而在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)，說(shuō)明Oct4與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。李秀娟等的研究結(jié)果顯示，食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Oct4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常組織，且Oct4蛋白的表達(dá)情況與腫瘤分化程度有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，敲除Oct4能明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，并下調(diào)增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antige，PCNA）、MMP2、MMP9的表達(dá)。另外，Oct4能促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），下調(diào)Oct4的表達(dá)能明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移與侵襲。上述研究結(jié)果均提示Oct4的表達(dá)可能與食管癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲亦有關(guān)。因此，本研究首先采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Oct4對(duì)照和Oct4 shRNA，實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)下調(diào)Oct4的表達(dá)能明顯降低食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的活力及遷移、侵襲能力。

細(xì)胞外基質(zhì)的降解主要由MMP所介導(dǎo)。MMP2在降解細(xì)胞外基質(zhì)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血管生成、腫瘤浸潤(rùn)的過(guò)程中起重要作用。MMP9是分子量最大的MMP，能夠降解包括膠原在內(nèi)的大部分細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而提高細(xì)胞的活動(dòng)能力。EMT是指具有極性排列整齊的上皮細(xì)胞因喪失黏性而轉(zhuǎn)化成為能夠移動(dòng)的、不穩(wěn)定的間質(zhì)細(xì)胞的一種生物學(xué)過(guò)程。在EMT的發(fā)生過(guò)程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）的表達(dá)下調(diào)，而間葉表型標(biāo)志物vimentin、N-cadherin的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)誘導(dǎo)EMT的細(xì)胞因子如Twist、Snail、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的表達(dá)上調(diào)。E-cadherin的表達(dá)下調(diào)、vimentin的表達(dá)上調(diào)使細(xì)胞表面的黏附力降低，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移。Twist是一種能使果蠅胚胎發(fā)生扭曲的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎來(lái)源的組織及細(xì)胞中呈高表達(dá)，而其水平于出生后降至最低。研究顯示，Oct4表達(dá)的下調(diào)能明顯抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移和侵襲，與MMP2、MMP9表達(dá)的下調(diào)有關(guān)。過(guò)表達(dá)Oct4能誘導(dǎo)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT，包括E-cadherin表達(dá)的下調(diào)，vimentin、N-cadherin表達(dá)的上調(diào)，Twist蛋白及mRNA表達(dá)的上調(diào)，進(jìn)而提示Oct4能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)降解蛋白及EMT形成相關(guān)蛋白，在一定程度上影響食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。因此，本研究繼續(xù)探討Oct4的表達(dá)下調(diào)對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Eca109中MMP2、MMP9、E-cadherin、vimentin、Twist蛋白表達(dá)情況的影響，結(jié)果顯示，下調(diào)Oct4的表達(dá)能明顯下調(diào)MMP2、MMP9、vimentin、Twist蛋白的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)。

綜上所述，下調(diào)Oct4的表達(dá)能通過(guò)抑制Eca109細(xì)胞中MMP2、MMP9、vimentin、Twist蛋白的表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin蛋白的表達(dá)，進(jìn)而降低食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的活力、遷移及侵襲能力。Oct4有望成為食管鱗狀細(xì)胞癌的治療靶點(diǎn)。