李藝洋，丁 一，王曉旭，王昕岑，王 睿，叢培旭，徐 杰,，薛長湖,2

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003；2.青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室，山東 青島 266235）

磷脂是一類廣泛存在于動物血液、大腦、心臟、骨骼肌和腎臟的含磷脂類，是生物細胞膜的重要組成部分[1]。根據(jù)結(jié)構(gòu)中頭部基團的差異，磷脂可分為磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）等[2]。1924年Feulgen和Voigt發(fā)現(xiàn)了兩類特殊磷脂[3]：其中，在甘油骨架sn-1位上僅存在醚鍵的磷脂被稱為醚磷脂；除醚鍵外還含有一個雙鍵的磷脂被稱為縮醛磷脂；前者主要為烷氧型磷脂酰膽堿（plasmanylcholine，aPC），而后者主要為縮醛型磷脂酰乙醇胺（plasmenylethonoamine，pPE）。越來越多的研究表明，縮醛磷脂和醚磷脂都具有獨特的生物活性，如神經(jīng)保護、抗氧化應(yīng)激、信息轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗腫瘤等[4-6]。

冰島刺參（Cucumaria frondosa）屬于光參類、瓜參科，其體壁內(nèi)含有皂苷等多種活性成分及海參磷脂、腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂等功能性脂質(zhì)[7]，是海參中品質(zhì)上乘的參種。本課題組前期實驗已發(fā)現(xiàn)冰島刺參是縮醛磷脂和醚磷脂的原料來源，并建立了縮醛磷脂及醚磷脂的分離純化方法[8]。研究表明，海參體內(nèi)提取的活性脂質(zhì)對阿爾茨海默癥等神經(jīng)退行性疾病有良好的預(yù)防和治療作用，如海參中的腦苷脂可預(yù)防SAMP8小鼠和腎上腺嗜鉻細胞瘤（pheochromocytoma，PC12）細胞的氧化應(yīng)激[9]，但其在神經(jīng)分化和營養(yǎng)方面的研究還較少。

神經(jīng)系統(tǒng)是由神經(jīng)元延伸形成神經(jīng)突起（包括樹突和軸突）組成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)，對于維持機體正常生理活動至關(guān)重要[10]。如果由于某些原因造成神經(jīng)元和神經(jīng)突起數(shù)量減少，則會導(dǎo)致阿爾茨海默癥等神經(jīng)退行性疾病[11]，這類疾病被證實與脂質(zhì)調(diào)控密切相關(guān)[12]。因此，尋找具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的活性物質(zhì)具有重要意義。

目前，大量的小分子天然海洋化合物（如二十二碳六烯酸、皂苷、海洋生物活性堿等）顯示出緩解和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛力[13-14]，但鮮見海洋源磷脂對神經(jīng)營養(yǎng)作用的報道。大鼠PC12細胞不僅具備神經(jīng)干細胞和成熟神經(jīng)細胞的雙重特性，且被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制和藥物作用機制方面的研究[15]。因此，本實驗選取冰島刺參為原料，提取、分離純化pPE和aPC，以PC12為體外細胞模型，研究不同結(jié)構(gòu)磷脂在促進細胞分化、突觸生長方面的神經(jīng)營養(yǎng)作用及構(gòu)效關(guān)系，以期為海洋食品的加工利用、海洋活性脂質(zhì)的功效探索以及相關(guān)功能性食品的開發(fā)提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰島刺參 青島市南山水產(chǎn)市場。

冷丙酮、氯仿、甲醇（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；Silica Gel 60（300～400 目） 加拿大Silicycle公司；氯仿、甲醇試劑（色譜純） 美國Muskegon 公司；Nucleosil 100-5 OH色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）德國Macherey-Nagel公司；PE（14∶0/14∶0）、PC（14∶0/14∶0）標準品美國Avanti Polar Lipids公司；PC12細胞（未分化）中國科學院上海生化與細胞研究所；RPMI-1640干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）（2.5S-NGF）美國Gibco公司；SYBR Green Master Mix美國Fermentas公司；β-actin抗體美國Sigma公司；突觸素（synaptophysin，SYN）抗體 英國Abcam公司。牛腦pPE為實驗室前期制備，純度為88.4%[8]。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀美國Thermo Fisher公司；HF90/HF240 CO2培養(yǎng)箱、HFsafe1200LC系列安全柜、Neufuge 13R臺式高速冷凍離心機上海力申科學儀器有限公司；iCycler iQ5系統(tǒng)實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）擴增儀美國Bio-Rad公司；12V DC 30W倒置生物顯微鏡 蔡司科技（蘇州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 pPE和aPC的分離、純化及純度鑒定

按照前期課題組研究方法[8]制備pPE和aPC。提取總脂，然后用2 倍體積冷丙酮沉淀并結(jié)合硅膠柱層析純化磷脂，得到的粗磷脂繼續(xù)通過硅膠柱（280 mm×800 mm）層析分離縮醛磷脂和醚磷脂。參考González-Domínguez等[16]的方法，采取液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對分離得到的縮醛磷脂和醚磷脂進行鑒定。參考Zhou Li等[17]的方法，根據(jù)精確分子質(zhì)量、保留時間及二級質(zhì)譜裂解規(guī)律進行結(jié)構(gòu)鑒定，利用PE（14∶0/14∶0）、PC（14∶0/14∶0）標準品與峰面積歸一化方法相結(jié)合計算純度。

1.3.2 PC12細胞培養(yǎng)和細胞存活率的測定

按照Wang Xiaoxu等[18]的方法稍加改動。未分化的PC12細胞在含5%胎牛血清、10%馬血清及1×105μg/L青霉素及鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期，用完全培養(yǎng)基配成密度為1×105個/mL的細胞懸液并接種于96 孔板，孵育24 h待細胞貼壁后更換為含不同質(zhì)量濃度（10、20、40 μg/mL）磷脂的2%胎牛血清-RPMI-1640培養(yǎng)基，每孔200 μL，每個質(zhì)量濃度6 個復(fù)孔；以不添加磷脂的2%胎牛血清-RPMI-1640培養(yǎng)基為空白對照。繼續(xù)培養(yǎng)48、96 h和144 h后，吸去培養(yǎng)基，加入終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT）溶液。培養(yǎng)4 h后加入酸化異丙醇吹打至藍紫色結(jié)晶完全溶解，用酶標儀于570 nm波長處檢測樣品和空白對照吸光度。細胞存活率按式（1）計算。

1.3.3 細胞分組

以二甲基亞砜為溶劑配制質(zhì)量濃度40 mg/mL的pPE和aPC母液，使用前用DMEM培養(yǎng)基進行梯度稀釋。未分化的PC12細胞按照如下形式進行分組：常規(guī)培養(yǎng)的對照組；添加10 ng/mL NGF培養(yǎng)的分化模型組；添加10 ng/mL NGF和5、20 μg/mL或40 μg/mL pPE和aPC溶液培養(yǎng)的處理組。

1.3.4 pPE和aPC對NGF誘導(dǎo)PC12細胞分化的影響

常規(guī)培養(yǎng)的PC12細胞添加10 ng/mL NGF和40 μg/mL牛腦pPE、冰島刺參pPE或aPC持續(xù)孵育6 d，每組3 個復(fù)孔，每隔2 d換液。軸突長度大于等于胞體長度的細胞認為是分化細胞。孵育第6天進行拍照，每孔隨機選擇5 個區(qū)域，每個區(qū)域平均約有20 個PC12細胞，對每個區(qū)域的PC12細胞進行細胞分化率、軸突長度及數(shù)目統(tǒng)計，結(jié)果取平均值。細胞分化率按式（2）計算。

軸突長度為從一個細胞體伸出的最長軸突與胞體長度的比值；軸突數(shù)目為從一個胞體伸出的軸突個數(shù)[19]。

1.3.5 免疫熒光測定SYN的分布與表達

細胞布板后在含有40 μg/mL不同磷脂的10 ng/mL NGF-2%胎牛血清-RPMI培養(yǎng)基中孵育24 h后，冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3 遍，加入4 g/100 mL多聚甲醛溶液，室溫固定40 min。PBS洗滌3 次后加入質(zhì)量分數(shù)0.4% Triton X-100溶液固定30 min以破壞細胞膜。用2 g/100 mL牛血清白蛋白溶液（PBS配制）37 ℃培養(yǎng)箱中封閉1 h。PBS洗滌3 次后分別加入對應(yīng)的一抗溶液（SYN按1∶1 000稀釋）4 ℃過夜[18]。清洗后添加熒光標記的二抗室溫避光孵育40 min。2 μg/mL 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）染色液復(fù)染20 min，封片劑封片，避光4 ℃保存，待激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

1.3.6 qPCR測定syn和GAP-43mRNA的表達

PC12細胞經(jīng)冷PBS漂洗3 次，進行總RNA的提取并計算純度和含量。采用SYBR Green I Master Mix通過qPCR檢測各目的基因mRNA的表達量。25 μL反應(yīng)體系：樣品cDNA 2.5 μL、SYBR Green 12.5 μL、上游和下游引物各0.75 μL、DEPC水8.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共45 個循環(huán)[20]。各基因mRNA表達量以β-actinmRNA表達量作為內(nèi)參校正，并將對照組表達量設(shè)為1。相關(guān)基因引物序列均由生工生物工程（上海）有限公司合成，具體序列如表1所示。

表 1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析

使用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，每組實驗重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標準差；空白對照組之間采用Student’st-test比較分析，多組之間比較采用單因素方差分析，P＜0.05被認為差異顯著，具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 冰島刺參中縮醛磷脂和醚磷脂的純度鑒定

圖 1 冰島刺參中縮醛磷脂和醚磷脂的純度鑒定Fig. 1 Purification and identification of pPE and aPC from Cucumaria frondosa

圖1 A、C 分別為純化后冰島刺參P E 和P C 的總離子流圖；圖1B、D分別為pPE和aPC主要分子種類的提取離子流圖。在負離子模式下，根據(jù)aPC產(chǎn)生的[M-CH3]-特征碎片與pPE產(chǎn)生的140.009 3[C2H7O4P]-和196.036 2[C5H11O5NP]-二級特征碎片離子，可以對其結(jié)構(gòu)進行定性分析。計算得到純化后冰島刺參pPE和aPC純度分別為91.0%和89.1%，其中，PE（p18∶0/20∶5）和PC（a18∶1/20∶5）分別為冰島刺參提取PE和PC的主要分子種類，將其用于后續(xù)實驗。

2.2 冰島刺參pPE和aPC對PC12細胞存活率和分化率的作用

圖 2 冰島刺參pPE和aPC對PC12細胞活力和NGF誘導(dǎo)的細胞分化的影響Fig. 2 Effects of pPE and aPC on cell viability and NGF-induced differentiation of PC12 cells

為評價海洋源磷脂對PC12細胞的神經(jīng)營養(yǎng)作用，首先應(yīng)考察其對細胞的增殖或毒性效應(yīng)，以確保后續(xù)實驗過程不是由于磷脂本身的細胞毒性而引起細胞變化。MTT實驗測定細胞存活率可用于評價細胞活性[21]。pPE在大腦和腎臟中特別豐富[22]，牛腦可以作為提取pPE的良好來源，為對比海洋生物源縮醛磷脂與陸地動物源縮醛磷脂的效果差異，同時設(shè)置牛腦pPE組進行對照實驗，結(jié)果如圖2A～C所示。在質(zhì)量濃度0～40 μg/mL下，牛腦pPE、冰島刺參pPE和aPC對細胞存活率沒有顯著影響，說明這3 種磷脂在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對PC12細胞無明顯細胞毒性，不影響細胞增殖，因此可用于后續(xù)實驗。通過PC12細胞的分化率研究不同結(jié)構(gòu)磷脂的神經(jīng)營養(yǎng)作用，結(jié)果如圖2D所示。3 種磷脂均具有促進細胞分化的作用；牛腦pPE、冰島刺參pPE和冰島刺參aPC組細胞分化率較模型組分別提高了10%、13%和8%，與模型組差異顯著（P＜0.05或P＜0.01）。這表明相比于醚磷脂，縮醛磷脂提高PC12細胞分化率的效果可能更佳，并且冰島刺參pPE較牛腦pPE對細胞分化的促進作用也更為明顯。以上結(jié)果表明，海洋源縮醛磷脂促神經(jīng)細胞分化的效果可能優(yōu)于陸地源，但具體原因和差異機制尚不明確，需要進一步實驗研究。

2.3 冰島刺參pPE和aPC對PC12細胞軸突長度和數(shù)目的影響

通過向NGF誘導(dǎo)PC12細胞模型中添加外源性不同結(jié)構(gòu)磷脂，觀察磷脂對該神經(jīng)樣細胞軸突生長和分支形成作用，結(jié)果如圖3所示。相比于模型組，冰島刺參pPE組細胞軸突長度大于4的細胞比例極顯著增多（P＜0.01），且冰島刺參pPE組具有更長軸突長度（4 倍胞體長度）的細胞比例相較于冰島刺參aPC組更高（圖3A）。此外，就軸突數(shù)目（圖3B）而言，所有磷脂處理組中軸突數(shù)目為2的細胞比例均較模型組極顯著提高（P＜0.01）；與模型組細胞相比，冰島刺參pPE組軸突數(shù)目為3的細胞比例提高了8%（P＜0.01），相比于牛腦pPE組與模型組的差異更為顯著，而冰島刺參aPC組軸突數(shù)目為3的細胞比例與模型組相比沒有顯著差異（P＞0.05），說明冰島刺參pPE比牛腦pPE能夠更有效地促進突觸的伸出，這與圖2D中促細胞分化作用的結(jié)果一致，進一步佐證了冰島刺參pPE在促神經(jīng)分化方面的作用。

圖 3 冰島刺參pPE和aPC（40 μg/mL）對NGF誘導(dǎo)PC12細胞的軸突長度（A）和數(shù)目（B）的影響Fig. 3 Effects of pPE and aPC (40 μg/mL) on neurite length (A) and neurite number (B) in NGF-induced PC12 cells

2.4 免疫熒光法測定冰島刺參pPE和aPC對SYN的影響

圖 4 冰島刺參pPE和aPC（40 μg/mL）孵育24 h后PC12細胞SYN免疫熒光染色Merge圖（×40）Fig. 4 Effect of pPE and aPC (40 μg/mL) on synaptophysin in PC12 cells evaluated by immunofluorescence staining (× 40)

圖4為添加不同海洋源磷脂處理孵育24 h后PC12細胞的分化情況，細胞核被DAPI染為藍色，SYN被標記為紅色，二者重疊后為Merge圖。在40 倍物鏡下觀察到，常規(guī)培養(yǎng)對照組PC12細胞呈圓形且無軸突，SYN僅在胞體表達。經(jīng)NGF誘導(dǎo)后模型組細胞長出軸突，而在40 μg/mL的牛腦pPE和冰島刺參pPE作用下，不僅分化細胞數(shù)目變多，且SYN在胞體和軸突的表達更加顯著，與模型組差異明顯，冰島刺參aPC的作用效果沒有2 種pPE強。因此，SYN的免疫熒光染色結(jié)果進一步表明，冰島刺參pPE促PC12細胞軸突生長的效果更佳，能更有效刺激神經(jīng)的生長。

2.5 冰島刺參pPE和aPC對syn和GAP-43表達的影響

圖 5 冰島刺參pPE和aPC對NGF誘導(dǎo)PC12細胞syn（A）和GAP-43 mRNA相對表達量（B）的影響Fig. 5 Effect of pPE and aPC on mRNA expression of syn (A) and GAP-43 (B) in NGF-induced PC12 cells

SYN是突觸囊泡的組成成分，GAP-43位于突觸前膜上，二者均與突觸的生長相關(guān)，在神經(jīng)元生長延伸、突觸囊泡形成等方面具有表征作用[23]。利用qPCR技術(shù)分析冰島刺參pPE和aPC處理對PC12細胞中syn、GAP-43mRNA相對表達量的影響，結(jié)果如圖5所示。在NGF誘導(dǎo)的PC12細胞分化模型組中，syn和GAP-43的mRNA相對表達量較對照組分別升高了25%和74%，差異極顯著（P＜0.01）。與模型組相比，除5 μg/mL冰島刺參aPC組外，其余磷脂處理組均極顯著提高了NGF誘導(dǎo)PC12細胞中syn和GAP-43的mRNA相對表達量（P＜0.01），并呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系；并且，pPE效果優(yōu)于aPC，冰島刺參pPE效果明顯優(yōu)于牛腦pPE，在質(zhì)量濃度為20 μg/mL時尤為突出，此質(zhì)量濃度下牛腦pPE和冰島刺參pPE組GAP-43mRNA表達量較對照組分別提高了4.6 倍和5.5 倍。

3 討 論

縮醛磷脂水平變化與阿爾茨海默癥密切相關(guān)，患者腦內(nèi)的縮醛磷脂水平顯著降低，是阿爾茨海默癥早期變化之一[24-26]，但具體機制尚不清楚。外源性縮醛磷脂的神經(jīng)活性對于減輕阿爾茨海默癥病癥已有報道[27]，臨床實驗也證明口服縮醛磷脂能緩解輕度阿爾茨海默癥患者的認知障礙[28]。

近幾年，海洋活性脂質(zhì)的作用逐漸受到關(guān)注。海參腦苷脂和海膽神經(jīng)節(jié)苷脂具有抗氧化[9]和神經(jīng)營養(yǎng)作用[20]，富含二十碳五烯酸的磷脂可改善Aβ42、Aβ1-40誘導(dǎo)的認知缺陷[29-30]和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導(dǎo)的帕金森癥癥狀[31]。這些研究結(jié)果表明海洋活性脂質(zhì)具有作為神經(jīng)營養(yǎng)膳食補充劑的潛力。目前，關(guān)于外源性磷脂神經(jīng)方面的活性研究主要集中在其對神經(jīng)損傷的保護作用上，對海洋源磷脂在促神經(jīng)分化方面的確切作用或功能鮮見報道，探究海洋源不同結(jié)構(gòu)磷脂的促分化效果十分必要。

鑒于此，本實驗通過柱層析法制備獲得冰島刺參pPE和aPC，并與牛腦pPE對比，研究冰島刺參pPE和aPC對PC12細胞神經(jīng)生長的活性。采用NGF誘導(dǎo)建立PC12細胞分化模型，結(jié)果表明，牛腦pPE、冰島刺參pPE和冰島刺參aPC在一定質(zhì)量濃度下均可顯著提高PC12細胞的分化率，顯著延長軸突長度、增加軸突數(shù)目。通過免疫熒光分析直接觀察pPE促神經(jīng)分化效果，進一步從分子水平上測定syn和GAP-43的mRNA表達量，結(jié)果表明，pPE與aPC均能增加syn和GAP-43基因表達，且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。pPE和aPC表現(xiàn)出顯著促進神經(jīng)生長效果時所需劑量較海參腦苷脂更低[18]。總體分析，一方面，縮醛磷脂效果優(yōu)于醚磷脂，這種效果差異可能依賴于結(jié)構(gòu)的差異，推測可能與縮醛磷脂具有不同于醚磷脂的烯醚鍵結(jié)構(gòu)有關(guān)[32]，pPE的烯醚鍵具有更強的自由基清除能力，從而更好地保護細胞[33]；另一方面，冰島刺參pPE具有較牛腦pPE更好的促神經(jīng)分化作用，推測海洋源縮醛磷脂在促神經(jīng)分化方面比陸地源縮醛磷脂有更大的潛力。

綜上所述，冰島刺參縮醛磷脂具有顯著促進PC12細胞分化的作用，有望成為促進神經(jīng)生長的功能性食品原料。但其具體促生長機制和通路尚不明確，需要后續(xù)實驗進一步研究。