董俊凡，宋 揚，季秀娜，李曉彬，劉可春，靳 夢,

（1.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）生物研究所，山東 濟南 250103；2.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）生物工程學院，山東 濟南 250353）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一種由多因素誘發(fā)的神經(jīng)退行性疾病[1]，病人臨床癥狀表現(xiàn)為運動緩慢、肌肉僵直和震顫。PD發(fā)病機制較為復雜，至今尚未明確，主要病理學特點是大腦黑質(zhì)中多巴胺神經(jīng)元大量死亡和α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-Syn）異常聚集導致Lewy小體的形成[2]。也有研究表明，PD的發(fā)病與E3泛素連接酶Parkin、PTEN誘導假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，Pink1）[3]和酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，Th）[4]基因表達異常有關(guān)。th的表達下降會造成多巴胺神經(jīng)元受損[5]；α-syn的過度表達[6-7]和parkin、pink1的表達水平異常都會導致線粒體受損[8-9]，影響線粒體的自噬功能[10]。多巴胺神經(jīng)元和線粒體受到損傷都會導致PD的發(fā)生。

斑馬魚因體外受精，胚胎發(fā)育速度快，胚胎和幼魚身體透明等特點，更適用于形態(tài)學觀察。斑馬魚作為一種常見的脊椎動物，與人類基因組同源性高達87%，信號通路調(diào)控也與人類有很高的相似性[11]。α-syn、parkin、pink1、th等在斑馬魚中均可找到相應的同源基因[3]?；谝陨显颍冒唏R魚建立PD模型已逐漸成為研究熱點[12]。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶鹽酸鹽（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）是一種可以誘導PD發(fā)生的神經(jīng)毒性物質(zhì)[13]。研究發(fā)現(xiàn)MPTP在斑馬魚體內(nèi)的作用機制與人類基本相同，都是通過產(chǎn)生的1-甲基-4-苯基-吡啶活性離子（1-methyl-4-phenylpyridinium，MMP+）作用于線粒體產(chǎn)生大量自由基，導致線粒體發(fā)生氧化損傷，引發(fā)線粒體功能障，最終導致PD病征[14-16]。因此，本實驗利用MPTP誘導斑馬魚PD模型，通過觀察其多巴胺神經(jīng)元、腦血管發(fā)育情況和行為學變化，研究魷魚生殖腺磷脂是否具有抗PD活性。Vmat、Fli1分別在斑馬魚多巴胺神經(jīng)元與血管中特異性表達[17-18]，因此，利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚Vmat:GFP、Fli1:GFP觀察多巴胺神經(jīng)元和腦部血管的發(fā)育情況。

魷魚生殖腺中含有豐富的磷脂[19]，與從大豆中提取的磷脂相比，從魷魚生殖腺中提取磷脂的支鏈脂肪酸是以二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）為主的多不飽和脂肪酸。DHA和EPA能夠通過激活Nrf2-ARE信號通路，緩解PD小鼠癥狀[20]。魷魚生殖腺中的磷脂主要為磷脂酰膽堿，磷脂酰膽堿是乙酰膽堿的前體，神經(jīng)細胞之間均需依靠乙酰膽堿傳遞信息，在腦神經(jīng)元之間建立穩(wěn)定的聯(lián)系[21]。磷脂酰膽堿在體內(nèi)水解為膽堿，膽堿能夠提高機體的抗氧化能力，對線粒體產(chǎn)生保護作用，維持線粒體功能正常[22]。基于以上原因，本研究探究魷魚生殖腺磷脂是否具有抗PD活性。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

轉(zhuǎn)基因斑馬魚Vmat:GFP、轉(zhuǎn)基因斑馬魚Fli1:GFP和野生型斑馬魚AB由山東省科學院生物研究所提供；成年雌、雄斑馬魚于斑馬魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中分開培養(yǎng)，給予照明14 h/黑暗10 h交替的周期光照，28 ℃養(yǎng)殖，并于每日10∶00、15∶00和20∶00分3 次喂食顆粒狀餌料和剛孵出的鹵蟲無節(jié)幼體。

魷魚生殖腺由蓬萊海洋（山東）股份有限公司提供。

Pronase E北京索萊寶科技有限公司；MPTP、1-苯基-2-硫脲（1-phenyl-2-thiourea，PTU）、亞甲基藍美國Sigma公司；RN2802 RNA試劑盒北京艾德萊生物科技有限公司；RR036A反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RR091A熒光定量PCR試劑盒日本Takara公司。

1.2 儀器與設備

斑馬魚水養(yǎng)殖系統(tǒng)北京愛生科技公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）儀 羅氏診斷（上海）有限公司；超微量分光光度計 香港基因有限公司；C1000 Touch梯度PCR儀美國Bio-Rad公司；體視熒光顯微鏡 德國Carl Zeiss公司；Zebrabox斑馬魚行為分析儀 法國Viewpoint公司。

1.3 方法

1.3.1 魷魚生殖腺磷脂的制備

參考戴志威[23]的方法，并作修改。稱取100 g魷魚生殖腺，用1 000 mL體積分數(shù)95%乙醇溶液攪拌提取3 次，每次提取5 h；提取液過濾后，蒸干，溶于50 mL體積分數(shù)95%乙醇溶液，再用400 mL正己烷萃取，收集正己烷層濃縮后干燥稱質(zhì)量。然后用正己烷配制質(zhì)量濃度0.5 g/mL的樣品溶液，加入10 倍體積丙酮混勻，靜置24 h，沉淀干燥后即得魷魚生殖腺磷脂樣品。用魷魚生殖腺磷脂樣品質(zhì)量除以原料質(zhì)量，計算得到樣品得率為3.75%。采用鉬藍比色法[24]測定得到魷魚生殖腺磷脂樣品中總磷脂質(zhì)量分數(shù)為91.3%。

1.3.2 斑馬魚胚胎的制備

選擇性成熟斑馬魚按雌雄比例1∶1，于17∶00—18∶00分開放入帶隔板的產(chǎn)卵缸中；次日上午8∶30抽取隔板，2 h后收取受精卵，用新鮮養(yǎng)魚水反復沖洗3 次，移入含2 mg/L亞甲基藍的新鮮養(yǎng)殖水中[25]，再置于28 ℃培養(yǎng)箱中孵化。

1.3.3 實驗流程及分組

將提取得到的褐色膏狀魷魚生殖腺磷脂通過超聲輔助溶于水中，配制成質(zhì)量濃度20 mg/mL的母液。用斑馬魚建立PD模型，通過分析受精后不同時間不同實驗組轉(zhuǎn)基因斑馬魚Vmat:GFP多巴胺神經(jīng)元與轉(zhuǎn)基因斑馬魚Fli1:GFP腦血管的發(fā)育情況，以及野生型斑馬魚AB行為學變化、PD相關(guān)基因（α-syn、parkin、pink1、th）表達情況，研究魷魚生殖腺磷脂是否具有抗PD活性，初步解釋其抗PD活性的機制。實驗流程如圖1所示。

圖 1 實驗流程圖Fig. 1 Flow chart of the experimental procedure adopted in this study

受精后1 d（day post fertilization，dpf）時，轉(zhuǎn)基因斑馬魚Vmat:GFP、Fli1:GFP胚胎和野生型斑馬魚AB胚胎用1 mg/mL Pronase E進行脫膜處理[26]，然后用新鮮養(yǎng)魚水清洗3 遍后放于6 孔板中，每孔30 條幼魚，分別設置：空白對照組：5 mL新鮮養(yǎng)魚水處理；MPTP處理組：5 mL 50 μmol/L MPTP溶液處理；5 mL不同終質(zhì)量濃度（3、10、20 μg/mL）魷魚生殖腺磷脂與終濃度50 μmol/L MPTP共處理組。轉(zhuǎn)基因斑馬魚Vmat:GFP、Fli1:GFP幼魚用含0.03 mg/mL PTU的新鮮養(yǎng)魚水配制給藥溶液，以抑制黑色素生成[27]，便于觀察多巴胺神經(jīng)元和腦血管熒光。給藥后放入28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每24 h換水重新給藥。

1.3.4 多巴胺神經(jīng)元及腦血管發(fā)育情況觀察

4 dpf時，在不同實驗組轉(zhuǎn)基因斑馬魚Vmat:GFP、Fli1:GFP中分別隨機選取8 條幼魚，分別用體視熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因斑馬魚Vmat:GFP幼魚多巴胺神經(jīng)元與轉(zhuǎn)基因斑馬魚Fli1:GFP幼魚腦血管的發(fā)育情況，拍照并記錄。使用Image-Pro Plus 5.1軟件分析熒光顯微鏡所得神經(jīng)元圖像，用Length工具測定多巴胺神經(jīng)元區(qū)域長度，用IOD工具測定多巴胺神經(jīng)元區(qū)域熒光密度總和。多巴胺神經(jīng)元區(qū)域相對長度、相對熒光密度和分別按式（1）、（2）計算。

1.3.5 行為學實驗

5 dpf時，在不同實驗組野生型斑馬魚AB中分別隨機選取8 條幼魚，放入48 孔板中，每孔各放1 條，加入1 mL新鮮養(yǎng)魚水，將48 孔板放入Zebrabox斑馬魚行為分析儀暗箱中15 min，使幼魚適應環(huán)境后進行行為學檢測。用Zeblab軟件采集20 min內(nèi)斑馬魚的運動軌跡，并導出數(shù)據(jù)，計算游動總距離和平均速率。

1.3.6 qPCR檢測PD相關(guān)基因的表達

5 dpf時，參照RNA試劑盒說明書對20 條不同實驗組野生型斑馬魚AB幼魚的總RNA進行提取，用超微量分光光度計測定不同實驗組RNA濃度，檢測結(jié)果A260nm/A280nm應在2.0～2.5之間；參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟用梯度PCR儀反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA為模板，加入相關(guān)引物用qPCR儀擴增各目的基因。擴增結(jié)束后，以rpl13a為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt相對定量法計算各基因的相對表達量。引物序列如表1所示。

表 1 實驗所用引物及其序列[28]Table 1 Primers sequences used in this study[28]

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用Graphpad Prism 7.0軟件對實驗結(jié)果進行單因素方差分析檢驗，結(jié)果以平均值±標準誤表示，P＜0.05表示數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 魷魚生殖腺磷脂對斑馬魚PD模型多巴胺神經(jīng)元發(fā)育的影響

由圖2 A可知，4 dpf 時，轉(zhuǎn)基因斑馬魚Vmat:GFP幼魚多巴胺神經(jīng)元已基本發(fā)育完整[29]。由圖2B、C可知，相較于對照組，MPTP處理組多巴胺神經(jīng)元區(qū)域相對長度高度顯著降低（P＜0.001），相對熒光密度總和極顯著降低（P＜0.01），多巴胺神經(jīng)元明顯缺失；而不同質(zhì)量濃度（3、10、20 μg/mL）魷魚生殖腺磷脂與MPTP共處理后，轉(zhuǎn)基因斑馬魚Vmat:GFP幼魚多巴胺神經(jīng)元區(qū)域相對長度和熒光密度總和較MPTP處理組均有不同程度地增加。本實驗結(jié)果表明，魷魚生殖腺磷脂可以降低斑馬魚多巴胺神經(jīng)元缺失比列。

圖 2 魷魚生殖腺磷脂對斑馬魚PD模型多巴胺神經(jīng)元的保護作用Fig. 2 Neuroprotective effect of squid gonadal phospholipids on dopamine neurons in zebrafish model of PD

2.2 魷魚生殖腺磷脂對斑馬魚PD模型腦血管發(fā)育的影響

由圖3可知，4 dpf時，對照組中轉(zhuǎn)基因斑馬魚Fli1:GFP幼魚腦血管已清晰可見且較為完整；MPTP處理組較對照組而言，腦血管損傷嚴重，數(shù)量顯著減少；相較于MPTP處理組，不同質(zhì)量濃度（3、10、20 μg/mL）魷魚生殖腺磷脂與MPTP共處理組中轉(zhuǎn)基因斑馬魚Fli1:GFP幼魚腦血管數(shù)量不同程度地增加。本實驗結(jié)果表明，魷魚生殖腺磷脂可以減輕由MPTP引起的腦血管損傷。

圖 3 魷魚生殖腺磷脂對斑馬魚PD模型腦血管的保護作用Fig. 3 Protective effect of squid gonadal phospholipids on blood vessels in the brain of zebrafish model of PD

2.3 魷魚生殖腺磷脂對斑馬魚PD狀行為的影響

圖 4 魷魚生殖腺磷脂對斑馬魚PD狀行為的抑制作用Fig. 4 Inhibitory effect of squid gonadal phospholipids on PD-like behavior of zebrafish

本研究對不同實驗組5 dpf時野生型斑馬魚AB進行行為學檢測，結(jié)果見圖4。相比于對照組，MPTP處理組斑馬魚出現(xiàn)PD狀行為，表現(xiàn)為游動總距離高度顯著減少（P＜0.001），游動平均速率明顯變慢，且運動遲緩；與MPTP處理組比較，不同質(zhì)量濃度（3、10、20 μg/mL）魷魚生殖腺磷脂與MPTP共處理組斑馬魚的游動總距離高度顯著增加（P＜0.001），游動平均速率明顯變快，運動能力恢復。本實驗結(jié)果表明，魷魚生殖腺磷脂可以顯著改善斑馬魚PD狀行為。

2.4 魷魚生殖腺磷脂對PD相關(guān)基因表達的影響

圖 5 魷魚生殖腺磷脂對斑馬魚PD相關(guān)基因表達的影響Fig. 5 Effect of squid gonad phospholipids on PD-related gene expression in zebrafish

為研究魷魚生殖腺磷脂抗PD活性的機制，用qPCR檢測不同實驗組野生型斑馬魚AB幼魚PD相關(guān)基因α-syn、parkin、pink1、th的表達水平。由圖5可知，與對照組相比，MPTP處理組α-synmRNA相對表達量極顯著上調(diào)（P＜0.01），parkin、pink1、thmRNA相對表達量顯著下調(diào)（P＜0.05）。與MPTP處理組相比，3、10、20 μg/mL魷魚生殖腺磷脂與MPTP共處理組α-synmRNA相對表達量均下降，且具有濃度依賴性。與MPTP處理組相比，parkinmRNA相對表達量在3 μg/mL和10 μg/mL魷魚生殖腺磷脂與MPTP共處理組中顯著上升（P＜0.05、P＜0.01），但在20 μg/mL共處理組中無顯著變化；pink1和thmRNA相對表達量均在3 μg/mL共處理組中顯著上升（P＜0.05），在10 μg/mL和20 μg/mL共處理組中無顯著變化。本實驗結(jié)果表明，魷魚生殖腺磷脂能夠調(diào)控MPTP誘導的PD相關(guān)基因的異常表達。

3 討 論

本研究采用斑馬魚建立PD模型，經(jīng)MPTP處理后斑馬魚表現(xiàn)出多巴胺神經(jīng)元缺損、腦部血管數(shù)量明顯減少、運動能力明顯下降，這與王榮春等[30]報道一致，表明MPTP成功誘導了斑馬魚PD模型。本研究結(jié)果表明，魷魚生殖腺磷脂可以改善斑馬魚PD模型上述一系列PD癥狀，說明魷魚生殖腺磷脂具有良好的抗PD活性。進一步研究魷魚生殖腺磷脂對PD相關(guān)基因的調(diào)控，探究魷魚生殖腺磷脂的抗PD作用機制。從本實驗結(jié)果可知，MPTP誘導PD相關(guān)基因α-synmRNA表達水平極顯著上調(diào)，parkin、pink1、thmRNA表達水平顯著下調(diào)。α-syn的過度表達可以使α-Syn異常聚集，導致線粒體損傷，引起PD的發(fā)生和發(fā)展[31]。Pink1和Parkin蛋白能夠維持線粒體的正常功能，當線粒體受到損傷時，Pink1會在線粒體外膜堆積，并聚集到線粒體，從而促進受損線粒體降解和再循環(huán)，維持健康的線粒體庫[32-33]。本實驗中MPTP使parkin、pink1mRNA表達水平下調(diào)，從而影響Pink1/Parkin途徑，使受損的線粒體不能被降解，致使MPTP組斑馬魚表現(xiàn)出PD癥狀。Th是參與多巴胺合成的限速酶，本實驗中MPTP使thmRNA表達水平降低，可導致多巴胺含量減少，誘發(fā)PD[34]。

與MPTP處理組相比，α-synmRNA表達水平在3、10、20 μg/mL魷魚生殖腺磷脂與MPTP共處理組中均顯著下降，有效減少了α-Syn聚集，提示魷魚生殖腺磷脂可緩解MPTP誘發(fā)PD癥狀。且隨魷魚生殖腺磷脂質(zhì)量濃度升高，α-synmRNA表達水平趨于正常。與MPTP處理組相比，3 μg/mL魷魚生殖腺磷脂可以使parkin和pink1的mRNA表達水平顯著升高，這可能有助于維持Pink1/Parkin途徑的正常作用，促進受損線粒體降解；20 μg/mL魷魚生殖腺磷脂共處理組parkin、pink1mRNA表達水平均無顯著變化，推測魷魚生殖腺磷脂在此質(zhì)量濃度時可以很好地保護線粒體免受損傷，不需要激活Pink1/Parkin途徑，因此parkin和pink1的表達水平均未受影響。與MPTP處理組相比，3 μg/mL魷魚生殖腺磷脂可以使thmRNA表達水平顯著上升，多巴胺神經(jīng)元有所恢復，與張智敏等[5]研究結(jié)果相符。10 μg/mL和20 μg/mL質(zhì)量濃度下，魷魚生殖腺磷脂對多巴胺神經(jīng)元具有恢復作用，且效果較3 μg/mL魷魚生殖腺磷脂更明顯（圖2），張智敏等[5]的研究中thmRNA表達水平升高，但本研究中thmRNA表達水平與MPTP處理相比并無明顯變化，推測其原因可能是10 μg/mL和20 μg/mL魷魚生殖腺磷脂對線粒體功能的保護作用較強，從而導致MPTP誘導的多巴胺神經(jīng)元凋亡不顯著[35]，因此th表達水平未受影響。已有研究證實，多種化合物都能夠通過防止線粒體損傷改善PD癥狀。艾地苯醌可以通過激活電子傳遞系統(tǒng)加速腺苷三磷酸的生成，改善線粒體功能障礙，保護線粒體DNA，緩解MPTP誘導的小鼠PD狀行為[36]。雷帕霉素能夠顯著提高由MPTP引起的PD小鼠線粒體膜電位和線粒體復合物I活性的降低，進一步改善PD小鼠的運動功能，提高PD小鼠的黑質(zhì)多巴胺含量[37]。異鼠李素-3-O-葡萄糖苷可以逆轉(zhuǎn)由MPP+引起的線粒體膜電位降低，阻斷MPP+導致的線粒體分裂，抑制線粒體損傷，減少神經(jīng)細胞株P(guān)C12細胞凋亡[38]。本實驗結(jié)果已初步確定魷魚生殖腺磷脂具有抗PD活性，但是其具體內(nèi)在機制仍需進一步研究與討論，特別是通過直接檢測線粒體指標，如測定線粒體膜電位和腺苷三磷酸含量等，闡述魷魚生殖腺磷脂是否可以保護線粒體免受損傷從而發(fā)揮抗PD活性。

本研究結(jié)果顯示，魷魚生殖腺磷脂可以有效減少多巴胺神經(jīng)元損傷、保護腦部血管、改善PD狀行為，提示其具有抗PD活性。通過檢測PD相關(guān)基因α-syn、parkin、pink1、th表達水平，推測其作用機制可能是魷魚生殖腺磷脂可以保護線粒體免受損傷，維持其正常功能，從而發(fā)揮抗PD作用。