張雪嬌，劉登勇,2,，王惠民

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095；3.中興大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究所，中國(guó) 臺(tái)灣 臺(tái)中 40249）

抗氧化是保持生物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的積極生理過(guò)程[1]，機(jī)體在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生自由基，當(dāng)自由基過(guò)量時(shí)將發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生以H2O2、超氧陰離子自由基、羥自由基和一氧化氮形式存在的活性氧（reactive oxygen species，ROS）物質(zhì)[2]。生物體內(nèi)多余的ROS會(huì)氧化和攻擊DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)[3]，導(dǎo)致衰老[4]和一些疾?。ò┌Y[5]、動(dòng)脈粥樣硬化[6]、中風(fēng)[7]、阿爾茨海默病[8]、帕金森病[9]和糖尿病[10]等）的發(fā)生。

近年來(lái)，生物活性肽作為一種天然抗氧化劑來(lái)源被人們廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白等肉類加工副產(chǎn)物可成為抗氧化肽來(lái)源[11]。León-López[12]和Sarbon[13]等研究表明，膠原蛋白水解物由于具有疏水性氨基酸含量較高、分子質(zhì)量較低等特點(diǎn)，能夠釋放電子和穩(wěn)定自由基，具有較高的抗氧化活性。眾所周知，口服生物活性肽多數(shù)很難穿透腸黏膜，在體循環(huán)中也會(huì)被迅速代謝。Liu等[14]研究結(jié)果表明，每天攝入膠原蛋白水解物可以改變?nèi)梭w血液中肽的組成比例，并保持較高水平的肽含量，這與膠原蛋白中含有較多的羥脯氨酸有關(guān)。羥脯氨酸作為亞氨基酸之一，其在肽序列中可使膠原衍生低聚肽對(duì)肽酶或蛋白酶產(chǎn)生高度抗性，口服后經(jīng)過(guò)胃腸消化吸收至血液中仍能以肽的形式存在，這表明可依據(jù)羥脯氨酸小肽能夠完整通過(guò)腸細(xì)胞中肽轉(zhuǎn)運(yùn)體被吸收至血液中的特點(diǎn)，更穩(wěn)定、高效地發(fā)揮肽的生物活性[15-16]。

研究表明，口服豬、雞、魚等動(dòng)物源膠原蛋白水解物后，人體血液中出現(xiàn)多種羥脯氨酸小肽，如Hyp-Gly、Ala-Hyp、Leu-Hyp、Ile-Hyp、Pro-Hyp、Ser-Hyp、Phe-Hyp、Glu-Hyp、Gly-Pro-Hyp、Glu-Hyp-Gly、Ser-Hyp-Gly、Ala-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly、Phe-Hyp-Gly、Leu-Hyp-Gly以及一些環(huán)肽[17-21]。雖已有部分對(duì)膠原蛋白水解物的抗氧化性和血液中膠原蛋白衍生羥脯氨酸小肽的氨基酸序列及含量方面的研究，但膠原蛋白水解物經(jīng)消化吸收后，血液中存在的羥脯氨酸小肽是否具有抗氧化性尚鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用測(cè)定1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)，ABTS）陽(yáng)離子自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基清除率4 種方法，評(píng)價(jià)血液中檢測(cè)到的15 條膠原蛋白衍生羥脯氨酸小肽的體外抗氧化活性，為膠原蛋白水解物以及相關(guān)小肽作為有效功能活性成分應(yīng)用于功能性食品等領(lǐng)域提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

二肽：Hyp-Gly（Hyp-G）、Ala-Hyp（A-Hyp）、Leu-Hyp（L-Hyp）、Ile-Hyp（I-Hyp）、Pro-Hyp（P-Hyp）、Ser-Hyp（S-Hyp）、Phe-Hyp（F-Hyp）、Glu-Hyp（E-Hyp）；三肽：Gly-Pro-Hyp（GP-Hyp）、Glu-Hyp-Gly（E-Hyp-G）、Ser-Hyp-Gly（S-Hyp-G）、Ala-Hyp-Gly（A-Hyp-G）、Pro-Hyp-Gly（P-Hyp-G）、Phe-Hyp-Gly（F-Hyp-G）、Leu-Hyp-Gly（L-Hyp-G）（純度＞95%）上海強(qiáng)耀生物科技有限公司。

DPPH、ABTS美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Tris北京索萊寶科技有限公司；焦性沒(méi)食子酸、過(guò)硫酸鉀、水楊酸、硫酸亞鐵、L-抗壞血酸上海麥克林生化科技有限公司；甲醇（分析純）天津福晨化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；鹽酸（分析純）錦州古塔城化學(xué)試劑有限公司；體積分?jǐn)?shù)30%過(guò)氧化氫（分析純）天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

透明孔板96/48 孔美國(guó)康寧公司；電子分析天平（萬(wàn)分之一）梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PE Victor X3多功能酶標(biāo)儀美國(guó)PerkinElmer公司；生化培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；單道移液器（1 mL/200 μL）德國(guó)Eppendorf公司；8 道移液器（50 μL/300 μL）北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DPPH自由基清除活性的測(cè)定

參考Sharma等[22]方法并略作改動(dòng)，用甲醇配制DPPH反應(yīng)溶液（0.065 mmol/L，超聲30 min，現(xiàn)配現(xiàn)用）。取96 孔板，每孔中加入50 μL樣品溶液和200 μL DPPH反應(yīng)液，混勻后室溫下避光反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液體系OD值。以蒸餾水代替DPPH反應(yīng)溶液作為樣品對(duì)照，蒸餾水代替樣品溶液作為空白，抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH自由基清除率按式（1）計(jì)算。每個(gè)樣品平行3 次，結(jié)果取平均值。

式中：OD0為蒸餾水代替DPPH反應(yīng)溶液體系的OD517nm；OD1為蒸餾水代替樣品溶液體系的OD517nm；OD2為樣品溶液與DPPH反應(yīng)液混合體系的OD517nm。

1.3.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性的測(cè)定

參考李新[23]的方法并略作改動(dòng)，用蒸餾水配制7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液，將ABTS溶液和過(guò)硫酸鉀溶液以體積比1∶1混勻，常溫下避光放置12～16 h，形成ABTS陽(yáng)離子儲(chǔ)備液，于4 ℃條件下貯存?zhèn)溆谩Ｊ褂们坝脽o(wú)水乙醇對(duì)ABTS陽(yáng)離子儲(chǔ)備液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使稀釋后溶液OD734nm為0.70±0.02，得到ABTS陽(yáng)離子工作液。在96 孔板中每孔加入20 μL樣品溶液以及180 μL ABTS陽(yáng)離子工作液，混勻，在30 ℃下反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液體系OD值。其中，以蒸餾水代替ABTS陽(yáng)離子工作液體系作為樣品對(duì)照，蒸餾水代替樣品溶液作為空白，以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照。ABTS陽(yáng)離子自由基清除率按式（2）計(jì)算。每個(gè)樣品平行3 次，結(jié)果取平均值。

式中：OD0為蒸餾水代替ABTS陽(yáng)離子工作體系的OD734nm；OD1為蒸餾水代替樣品溶液體系的OD734nm；OD2為樣品溶液與ABTS陽(yáng)離子工作液混合體系的OD734nm。

1.3.3 羥自由基清除活性的測(cè)定

參考張新霞[24]的方法并略作改動(dòng)。取48 孔板，每孔中加入樣品溶液、6 mmol/L硫酸亞鐵溶液、6 mmol/L過(guò)氧化氫溶液各100 μL，在37 ℃下恒溫預(yù)熱10 min后加入100 μL 6 mmol/L水楊酸乙醇溶液，繼續(xù)于37 ℃下恒溫加熱30 min，用酶標(biāo)儀在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液體系OD值。其中，蒸餾水代替樣品溶液作為空白，蒸餾水代替過(guò)氧化氫溶液作為樣品對(duì)照，以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照。羥自由基清除率按式（3）計(jì)算。每個(gè)樣品平行3 次，結(jié)果取平均值。

式中：OD0為蒸餾水代替樣品溶液體系的OD510nm；OD1為蒸餾水代替過(guò)氧化氫溶液體系的OD510nm；OD2為樣品溶液與硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫和水楊酸乙醇溶液混合體系的OD510nm。

1.3.4 超氧陰離子自由基清除活性的測(cè)定

參考Zhang Qingan等[25]的方法并略作改動(dòng)。取48 孔板，每孔中加入450 μL Tris-HCl溶液（50 mmol/L、pH 8.2）預(yù)熱25 min，然后加入100 μL樣品溶液和40 μL 6 mmol/L鄰苯三酚溶液，在25 ℃下準(zhǔn)確反應(yīng)4 min后加入50 μL 8 mol/L鹽酸溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于320 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液體系OD值。以蒸餾水代替樣品溶液作為空白，蒸餾水代替鄰苯三酚溶液作為樣品對(duì)照，以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照。超氧陰離子自由基清除率按式（4）計(jì)算。每個(gè)樣品平行3 次，結(jié)果取平均值。

式中：OD0為蒸餾水代替樣品溶液體系的OD320nm；OD1為蒸餾水代替鄰苯三酚溶液體系的OD320nm；OD2為樣品溶液與鄰苯三酚溶液反應(yīng)體系的OD320nm。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用Origin 2018軟件繪圖，Excel 2017軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基清除活性

圖 1 羥脯氨酸二肽對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig. 1 Scavenging capacity of hydroxyproline-containing dipeptide onDPPH radicals

圖 2 羥脯氨酸三肽對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig. 2 Scavenging capacity of hydroxyproline-containing tripeptide on DPPH radicals

由圖1、2可知，15 條羥脯氨酸小肽中，8 條二肽以及7 條三肽均具有一定的DPPH自由基清除活性。8 條二肽中，二肽L-Hyp的DPPH自由基清除活性最強(qiáng)，清除率最高達(dá)23.6%；較高濃度時(shí)，與其余5 條三肽相比，三肽P-Hyp-G和S-Hyp-G的DPPH自由基清除活性較強(qiáng)，濃度3.0 mmol/L時(shí)，清除率分別為16.4%和16.8%。15 條羥脯氨酸小肽的DPPH自由基清除能力均隨濃度的增加而增強(qiáng)，但增幅較小，且呈一定的濃度依賴性。15 條羥脯氨酸小肽的DPPH自由基清除率遠(yuǎn)小于VC陽(yáng)性對(duì)照組，除二肽L-Hyp相對(duì)較高外，其余小肽均低于15%。此外，15 條羥脯氨酸小肽的DPPH自由基清除率曲線變化趨勢(shì)相近，部分曲線幾乎重疊，表明羥脯氨酸二肽和三肽表現(xiàn)出相似的DPPH自由基清除能力，但活性均較低。

2.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性

圖 3 羥脯氨酸二肽對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力Fig. 3 Scavenging capacity of hydroxyproline-containing dipeptide on ABTS cation radicals

圖 4 羥脯氨酸三肽對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力Fig. 4 Scavenging capacity of hydroxyproline-containing tripeptide on ABTS cation radicals

由圖3、4可知，15 條羥脯氨酸小肽中二肽L-Hyp、I-Hyp、E-Hyp、Hyp-G、A-Hyp和三肽P-Hyp-G、F-Hyp-G、E-Hyp-G、L-Hyp-G具有ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性，并隨著濃度的增加活性增強(qiáng)，其他序列小肽均未檢測(cè)出ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性。濃度3.0 mmol/L時(shí)，二肽L-Hyp和I-Hyp的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率最高，分別為57.8%和57.7%，二肽E-Hyp、Hyp-G、A-Hyp和三肽P-Hyp-G、F-Hyp-G、E-Hyp-G、L-Hyp-G的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率均較低，均小于15%。有研究表明，ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性與抗氧化性之間存在直接聯(lián)系。20 種氨基酸中半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸、精氨酸、組氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸具有ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性，說(shuō)明氨基酸中疏水性氨基酸具有較高的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力[26]，但過(guò)多的疏水性氨基酸存在于肽中會(huì)降低肽的溶解度，進(jìn)而降低肽的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力[27]。由圖3、4可知，亮氨酸和異亮氨酸本身雖不具有ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性，但與羥脯氨酸結(jié)合形成二肽后，L-Hyp和I-Hyp的活性均較高，而含有亮氨酸的羥脯氨酸三肽L-Hyp-G活性較低，由此可見(jiàn)，肽的自由基清除活性與氨基酸種類、組成和序列相關(guān)，但與肽鏈長(zhǎng)短無(wú)關(guān)[28]。結(jié)果表明，羥脯氨酸小肽中L-Hyp、I-Hyp能夠有效清除部分ABTS陽(yáng)離子自由基，對(duì)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)有一定的影響。

2.3 羥自由基清除活性

圖 5 羥脯氨酸二肽對(duì)羥自由基的清除能力Fig. 5 Scavenging capacity of hydroxyproline-containing dipeptide on hydroxyl radicals

圖 6 羥脯氨酸三肽對(duì)羥自由基的清除能力Fig. 6 Scavenging capacity of hydroxyproline-containing tripeptide on hydroxyl radicals

由圖5、6可知，15 條羥脯氨酸小肽均具有一定的羥自由基清除能力，并且隨濃度的增加而升高。濃度為3.0 mmol/L時(shí)，羥脯氨酸二肽的羥自由基清除能力由大到小依次為F-Hyp（50.3%）＞I-Hyp（50.0%）＞S-Hyp（48.3%）＞P-Hyp（46.3%）＞E-Hyp（43.9%）＞L-Hyp（43.0%）＞A-Hyp（41.9%）＞Hyp-G（38.5%）；濃度為3.0 mmol/L時(shí)，羥脯氨酸三肽的羥自由基清除能力由大到小依次為F-Hyp-G（47.9%）＞S-Hyp-G（47.8%）＞A-Hyp-G（46.6%）＞GP-Hyp（43.1%）＞L-Hyp-G（42.8%）＞E-Hyp-G（41.3%）＞P-Hyp-G（31.0%）。濃度為3.0 mmol/L時(shí)，15 條羥脯氨酸小肽的羥自由基清除率均在30%～50%之間。脯氨酸小肽具有較高的羥自由基清除活性，可能與肽序列中含有疏水性氨基酸有關(guān)，因過(guò)多的疏水性氨基酸會(huì)降低活性肽的溶解度，使小肽具有較高的羥自由基清除活性[27]。而羥自由基是生物體內(nèi)最活潑、毒性最強(qiáng)的氧族自由基之一，對(duì)生物體影響較大，可與生物體內(nèi)氨基酸、DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。羥自由基可使肽鍵斷裂產(chǎn)生羰基，破壞蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)胞造成損傷[3]。以上結(jié)果表明，15 條羥脯氨酸小肽均可有效清除羥自由基，對(duì)生物體的自由基損傷有一定的保護(hù)作用。

2.4 超氧陰離子自由基清除活性

圖 7 羥脯氨酸二肽對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力Fig. 7 Scavenging capacity of hydroxyproline-containing dipeptide on superoxide anion radicals

圖 8 羥脯氨酸三肽對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力Fig. 8 Scavenging capacity of hydroxyproline-containing tripeptide on superoxide anion radicals

由圖7、8可知，15 條羥脯氨酸二肽及三肽均具有較高的超氧陰離子自由基清除能力，并隨濃度的增加呈線性升高趨勢(shì)。濃度3.0 mmol/L時(shí)，羥脯氨酸二肽的超氧陰離子自由基清除能力由大到小依次為Hyp-G（83.7%）＞A-Hyp（76.4%）＞L-Hyp（72.7%）＞I-Hyp（72.2%）＞P-Hyp（68.5%）＞S-Hyp（66.2%）＞F-Hyp（64.5%）＞E-Hyp（60.1%）；濃度為3.0 mmol/L時(shí)，羥脯氨酸三肽的超氧陰離子自由基清除能力由大到小依次為GP-Hyp（82.2%）＞E-Hyp-G（75.8%）＞S-Hyp-G（73.2%）＞A-Hyp-G（70.5%）＞P-Hyp-G（68.3%）＞F-Hyp-G（67.0%）＞L-Hyp-G（64.7%）；濃度為3.0 mmol/L時(shí)，15 條羥脯氨酸小肽的超氧陰離子自由基清除率均在60%～85%之間，其中二肽Hyp-G和三肽GP-Hyp的超氧陰離子自由基清除活性最高，分別為83.7%和2.2%。超氧陰離子自由基是生物體內(nèi)產(chǎn)生的第1個(gè)自由基，在細(xì)胞及生物體中具有很強(qiáng)的氧化毒性[3]。以上結(jié)果表明，15 條羥脯氨酸小肽在體外抗氧化實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出可減少超氧陰離子自由基對(duì)細(xì)胞及生物體損傷的能力。

3 結(jié) 論

膠原蛋白物經(jīng)消化吸收后，在血液中存在的序列為Hyp-Gly、Ala-Hyp、Leu-Hyp、Ile-Hyp、Pro-Hyp、Ser-Hyp、Phe-Hyp、Glu-Hyp、Gly-Pro-Hyp、Glu-Hyp-Gly、Ser-Hyp-Gly、Ala-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly、Phe-Hyp-Gly、Leu-Hyp-Gly。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定上述15 條羥脯氨酸小肽的DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基的清除能力，結(jié)果表明，15 條羥脯氨酸小肽中部分小肽具有一定的抗氧化能力，但均能很好地淬滅超氧陰離子自由基和羥自由基，其中二肽Leu-Hyp、Ile-Hyp的體外抗氧化活性最好，有成為天然抗氧化劑的潛力。同時(shí)，由于羥脯氨酸的酶抗性，及其在食品加工、胃消化和酶解時(shí)更穩(wěn)定、更高效的特點(diǎn)[29]，羥脯氨酸小肽可作為有效的功能活性成分應(yīng)用于功能性食品等領(lǐng)域。