王冰，余晶晶，蔡君蘭，王昇，劉克建，趙曉東，劉紹鋒，秦亞瓊，謝復煒，王曉瑜

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開封區(qū)楓楊街2號 450001

口含煙是一種重要的新型煙草制品，不產(chǎn)生煙氣，又能滿足尼古丁攝入的需求。隨著全球控煙形勢的日趨嚴峻，口含煙因其獨特的使用方式逐漸成為煙草消費的重要補充形式以及國際煙草領域的重要發(fā)展趨勢[1-4]。目前市場上的口含煙主要有3 類產(chǎn)品形式，分別為濕含煙（美式濕含煙Moist snuff /瑞典含煙Snus）、含化型制品、膠基型制品；其核心成分仍然是煙草（包括煙絲、煙草碎片、煙草顆粒及煙末等）或煙草關鍵成分（如煙堿、煙草香味物質(zhì)等）提取物[5-6]。

在煙草加工過程和卷煙燃燒過程中共有4 種類型的亞硝胺生成，它們包括：揮發(fā)性亞硝胺（VANs）、煙草特有亞硝胺（TSNAs）、非揮發(fā)性亞硝胺和N-亞硝基氨基酸[7]。目前國內(nèi)外展開了大量關于TSNAs測定及形成機理的研究[8-9]，揮發(fā)性亞硝胺方面也有文獻報道[10-11]，但在國內(nèi)尚未有煙草中亞硝基氨基酸方面的研究。

亞硝基氨基酸是由煙草中的氨基酸以及帶有仲氨基的蛋白質(zhì)發(fā)生亞硝化反應生成的。截止目前，口含煙中共有11 種N-亞硝基氨基酸被測定出來，而其中4 種N-亞硝基肌氨酸（N-Nitrososarcosine，NSAR）、3-（N- 甲基亞硝基氨基） 丙酸（3-(N-methylnitrosamino) propionic acid ，MNPA）、4-（N-甲基亞硝基氨基）丁酸（4-(N-methylnitrosamino) butyric acid，MNBA）、亞硝基氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸（Nitrosoazetidine-4-carboxylic acid ，NAzCA）在動物實驗中被確認為致癌物，可誘發(fā)小鼠肝癌、肺癌、膀胱癌、食道癌，被IARC 列入無煙氣煙草制品28 種有害物質(zhì)名單之中[12-13]。國外對口含煙中N-亞硝基氨基酸的文獻報道主要集中在1985 年到1999 年[14-21]，主要采用重氮甲烷衍生-氣相色譜-TEA 方法對口含煙中N-亞硝基氨基酸含量及隨存貯條件的變化進行了研究；重氮甲烷具有毒性、容易爆炸，且操作過程極為繁瑣。1989 年，James 等研制了液相色譜與化學發(fā)光檢測器的接口[22]；1999 年，Cheng 等嘗試使用離子對試劑高效液相色質(zhì)譜檢測NSAR、NPRO、NTCA 及NMTCA 四種亞硝基氨基酸[23]，從而為煙草中亞硝基氨基酸的分析提供了新的思路。

本文針對口含煙中重點關注的NSAR、MNPA、MNBA 及NAzCA，通過對前處理條件和儀器方法的優(yōu)化，建立了一種簡單、定量準確的LC-MS-MS 分析方法。為了減少亞硝基氨基酸對口含煙吸食者健康可能造成的傷害，控制它們在口含煙中的含量提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

14 種市售口含煙樣品。樣品信息如表1 所示。

表1 14 種市售口含煙樣品信息Tab.1 Informations of 14 kinds of commercially available oral tobacco samples

標準品：N-亞硝基肌氨酸（N-Nitrososarcosine，NSAR）、3-（N- 甲基亞硝基氨基） 丙酸（3-(N-methylnitrosamino) propionic acid，MNPA）、4-（N- 甲基亞硝基氨基） 丁酸（4-(N-methylnitrosamino) butyric acid，MNBA）、亞硝基氮雜環(huán)丁烷-2- 羧酸（Nitrosoazetidine-2-carboxylic acid，NAzCA）；N- 亞硝基肌氨酸-d3（N-Nitrososarcosine，NSAR- d3）、3-（N- 甲 基亞硝基氨基） 丙 酸-d3（3-(N-methylnitrosamino) propionic acid，MNPA-d3）、4-（N- 甲基亞硝基氨 基） 丁 酸-d3（4-(N-methylnitrosamino) butyric acid，MNBA-d3）、亞硝基氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸-d5（Nitrosoazetidine-4-carboxylic acid，NAzCA-d5）（純度≥98%，上海安譜公司）。

試劑：乙腈（色譜純，美國Dikma 公司）；乙酸（色譜純，美國Tedia 公司）；乙酸乙酯（色譜純，美國Dikma 公司）；甲酸（色譜純，美國Tedia 公司）。

凈化柱：BIOTAGE isolute SLE（5mL）。

儀器：API55000 質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）；Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； Milli-Q50 超純水儀（美國MILLIPORE 公司）；KQ-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CP2245 電子天平（感量：0.0001 g，德國Sartorius 公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI）。

1.2 樣品前處理

對于膠基型口含煙，先稱取1 g 樣本，加入1 mL正己烷分散樣本；對于美式濕含煙、瑞典含煙含化型制品，直接稱取1 g 或1 袋于50 mL 萃取離心管中。加入10 mL 含有內(nèi)標的去離子水，于2500 rpm 下，渦旋30 min，取萃取液5 mL，加于ISOLUTE 硅藻土固相支撐液液萃取柱（BIOTAGE isolute SLE），用30 mL 乙酸乙酯（含2%乙酸）分三次洗脫，每次10 mL，收集洗脫液，45℃下濃縮至干，用0.5 mL 去離子水復溶、混勻?；靹蚝筮MLC-MS/MS 分析。分析條件見表2。

色譜柱：Waters Atlantis? T3 分析柱（150 mm ×2.1 mm，3.0 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：A：0.1%（v/v）甲酸水溶液，B：乙腈溶液，流速0.25 mL/min，梯度洗脫條件見表2；分析時間：5 min；進樣體積：5 μL。離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；電噴霧電壓：-4500 V；氣簾氣壓力：30 psi；輔助氣1 壓力：60 psi；輔助氣2 壓力：60 psi；離子源溫度：500 ℃；各化合物的定量離子對、定性離子對、駐留時間、碰撞能量（CE）及去簇電壓（DP）參見表3。

表3 亞硝基氨基酸質(zhì)譜檢測參數(shù)Tab. 3 Determination parameters of N-nitrosamino acids by mass spectrometry

2 結(jié)果

四種亞硝基氨基酸的結(jié)構(gòu)式如圖1 所示，可知亞硝基氨基酸中，氨基上的氮原子分別形成N-C、N-N共價鍵，常規(guī)分析氨基酸的氨基所發(fā)生的衍生反應，亞硝基氨基酸很難發(fā)生，因此，本實驗選擇直接分析亞硝基氨基酸原型。

圖1 4 種亞硝基氨基酸結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structural formulas of four N-nitrosamino acids

2.1 色譜柱的選擇

4 種亞硝基氨基酸目標物均為水溶性極性小分子，實驗中首先考慮了親水作用色譜柱Agilent HILIC Plus（100 mm×2.1mm，3.5 μm）的分離效果，發(fā)現(xiàn)HILIC 柱子并不能很好的保留四種亞硝基氨基酸。四種亞硝基氨基酸的保留時間均在1.5min左右。

為達到好的分離效果，選取五種高比例水相耐受柱Agilent ZORBAX SB-AQ （100 mm × 2.1 mm，3.5 μm），Agilent ZORBAX BONUS-RP （100 mm × 2.1 mm, 1.8 μm），Agilent Proshell 120 EC-C8（100 mm × 3.0 mm，2.7 μm），Waters Atlantis ? T3（150 mm × 2.1 mm，3 μm），Thermo Accucore PFP（150 mm × 2.1 mm，2.6 μm）進行了對比實驗。4 種目標物在5 種分析柱上的分離效果如圖2 所示。在PFP 和SB-AQ 柱上保留比較差，出峰均在2 min 前；BONUS-RP 柱子對NSAR、NAzCA 保留效果好，但NSAR 出雙峰，NAzCA 的靈敏度差，響應較低，而對MNPA、MNBA 保留效果差；EC-C8 與T3 柱子對4 種目標物的保留效果相似，出峰均在2 min以后，考慮到T3 柱子可以耐受100%水相，通過調(diào)整流動相可以進一步調(diào)高目標物在色譜上的分離度，實驗重復性會更好，因此選T3 柱子為最終實驗用色譜柱。

2.2 流動相條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相的確定

為了得到最好的峰型和響應值，對流動相和洗脫梯度條件進行了優(yōu)化。采用乙腈為流動相B，分別采用0.1%甲酸水溶液，5 mmol/L 甲酸銨水溶液、1%甲酸水溶液為流動相A 進行試驗。

研究結(jié)果表明，流動相A 中加入一定比例的甲酸銨有助于亞硝基氨基酸化合物的離子化，質(zhì)譜響應高，但出峰時間快，4 種化合物保留時間短，影響口含煙樣品中4 種目標化合物的測定。流動相A 中加入一定比例的甲酸，亞硝基氨基酸的響應較加入甲酸銨時低，但并不影響樣品中目標物的定量，而且加入一定比例的甲酸能顯著提高目標物在色譜柱上的保留，使樣品中4 種目標化合物得到有效分離, 實驗結(jié)果如圖3 所示。當甲酸比例由0.1 %增加至1 %時，保留時間沒有顯著延長，質(zhì)譜響應稍降低；因此選用0.1%的甲酸水溶液為流動相A。

圖2 4 種亞硝基氨基酸在5 種色譜柱上的保留Fig.2 Retention of four N-nitrosamino acids on five chromatographic columns

圖3 流動相中添加甲酸銨和甲酸對4 種亞硝基氨基酸保留的影響Fig.3 Effects of ammonium formate and formic acid on retention of four N-nitrosamino acids in mobile phase

2.2.2 流動相梯度條件優(yōu)化結(jié)果

采用口含煙實際樣品對流動相梯度條件進行優(yōu)化，最終條件如表2 所示。在實驗條件下，標樣、及樣品中目標化合物均得到基線分離，峰形良好，分離色譜圖見圖4。

圖4 標樣(A)及樣品(B)中四種亞硝基氨基酸色譜質(zhì)譜圖Fig.4 Chromatogram mass spectrometry of four N-nitrosamino acids in standard sample(A) and tobacco sample(B)

2.3 質(zhì)譜條件的確定

在正離子模式、負離子模式下以流動注射的方式對各分析物的標準溶液（5 μg/mL）進行全掃描，結(jié)果表明：目標物在負離子模式下響應遠高于正離子模式下響應。因此選擇負離子模式對目標物進行分析，確定了各分析物的母離子（[M-H]-），然后分別以[M-H]-選擇各分析物的子離子（碎片），每個分析物先選擇2 個碎片，再從中選取信號較強、又無互相干擾的碎片定性和定量。優(yōu)化后的MRM 條件及碰撞能和去簇電壓見1.2 中表3 所示。

2.4 萃取溶劑、萃取方式及時間的優(yōu)化

參考已有文獻所用提取溶劑，對純水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯提取口含煙樣品中亞硝基氨基酸的效果進行考察。水溶液與甲醇的萃取效率高，且萃取效率相當；乙酸乙酯萃取效率最低。比較了渦旋、超聲及振蕩三種方式的萃取效果。實驗結(jié)果表明，渦旋、超聲兩種萃取方式的萃取效率基本相當，均比振蕩方式萃取效率高10%以上。對萃取時間從5 min 到60 min 進行了考察，結(jié)果顯示，30 min 以后，4 種亞硝基氨基酸萃取量達到平臺而不再上升。每次實驗平行做3 次，取其均值作圖，SD 如圖示意，實驗結(jié)果見圖5。

2.5 凈化方式的選擇

口含煙樣品采用去離子水萃取后，萃取液呈深棕色液體，基質(zhì)復雜；根據(jù)亞硝基氨基酸酸為極性小分子的性質(zhì)，嘗試了3 種思路對樣品進行凈化。①借鑒QuEChERS 方法，考察了Bond Elut C18、Bond Elut Carbon 兩種吸附劑的凈化效果，結(jié)果表明：Bond Elut Carbon 對樣本基質(zhì)有一定的凈化作用，但同時對目標化合物有一定的吸附，4 種化合物與對照樣品相比，響應大幅下降。②一般氨基酸的凈化多采用陽離子交換，其原理是利用了氨基的電負性，但是亞硝基氨基酸結(jié)構(gòu)中亞硝基取代了氨基上的氫原子，降低了電負性，因此在凈化時，首先考慮了分子結(jié)構(gòu)中的羧基，選用了Bond Elut SAX 強陰離子交換柱和具有非極性及陰離子交換兩用作用的Bond Elut Plexa PAX兩種小柱進行固相萃取，結(jié)果表明：4 種化合物在兩種小柱上均不保留，也達不到凈化效果。③固相支撐液液萃?。⊿LE）以比表面積高、化學惰性好的多孔硅藻土為液液分配載體，充分發(fā)揮硅藻土多孔性、大比表面、低表面活性等特點，快速地吸附樣品基質(zhì)中的水分，多孔的硅藻土表面能夠形成一層薄薄的液膜，當采用有機溶劑洗脫時，在互不相溶的兩相實現(xiàn)快速微觀液液萃取。SLE 具有不易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象、基質(zhì)效應降低和需要樣品量少等優(yōu)點，并可實現(xiàn)高通量樣品操作，是分析實驗室的一種高效樣品前處理工具。 SLE 使用相應的萃取柱，僅需上樣和洗脫兩步，即可從水相中萃取目標化合物。從亞硝基氨基酸的結(jié)構(gòu)來看，由于亞硝基取代了氨基上的氫原子，增加了亞硝基氨基酸的疏水性，其在有機溶劑乙酸乙酯中還是有相當?shù)娜芙舛鹊?。萃取溶劑?yōu)化實驗表明，假設水的萃取效率是100%，相同樣品量、相同溶劑體積下，乙酸乙酯對四種亞硝基氨基酸的萃取效率是大于50%的。因此，4 種亞硝基氨基酸在乙酸乙酯中均具有相當?shù)娜芙舛?。選取BIOTAGE isolute SLE 硅藻土液液萃取柱對樣品進行凈化，用乙酸乙酯（含2%乙酸）洗脫，實驗結(jié)果表明：30 mL 乙酸乙酯可將目標物完全洗脫，樣品濃縮復溶后，進LC-MS-MS 分析，4 種亞硝基氨基酸峰形良好，可達基線分離，且靈敏度較高，完全滿足樣品測試需要，樣本中4 種目標物MRM 譜圖如2.2.2 中圖4（B）所示。

圖5 萃取溶劑(A)及萃取方式(B)的選擇Fig.5 Selection of extraction solvent (A) and extraction method (B)

2.6 標準工作曲線、檢出限和定量限

N-亞硝基肌氨酸（NSAR）、3-（N-甲基亞硝基氨基）丙酸（MNPA）、4-（N-甲基亞硝基氨基）丁酸（MNBA）和亞硝基氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸（NAzCA）標準工作溶液濃度范圍分別為10～500 ng/mL；50～2500 ng /mL；10～500 ng /mL；10～500 ng /mL。標準工作溶液中內(nèi)標NAzCA- d5、NSAR- d3、MNBA- d3 濃度均為50.0 ng/mL，MNPA-d3 濃度為250.0 ng/mL。分別對標準工作溶液進行HPLC-MS/MS 分析，并以亞硝基氨基酸化合物與內(nèi)標物峰面積比對濃度比進行線性回歸，得到各目標化合物的標準工作曲線。以不低于3 倍性噪比為檢出限，以不低于10 倍性噪比為定量限，結(jié)果如表4 所示。

2.7 基質(zhì)效應考察

分別采用口含型、含化型、膠基型制品提取溶液配制基質(zhì)匹配校正溶液，比較和溶劑校正曲線斜率的差異性，以評價基質(zhì)效應。實驗結(jié)果表明（表5），采用口含型、含化型、膠基型三種基質(zhì)配制標準曲線方程的斜率與采用溶劑配制標準曲線方程的斜率之比值（SR）均在94.4%～105.6%之間，表明該方法基質(zhì)效應較小，可采用溶劑配標方式。分析其原因主要是因為前處理方法中采用了BIOTAGE isolute SLE 硅藻土液液萃取柱，通過液液萃取，及后續(xù)的濃縮復溶，凈化了樣本基質(zhì)，部分除去了影響離子化的干擾成分， 另外實驗時，相應的氘代內(nèi)標也起到了校正作用。

表4 4 種亞硝基氨基酸的線性方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限Tab.4 Linear equations, correlation coefficients, limits of detection and quantitation of the four N-nitrosamino acids

表5 3 種口含煙的基質(zhì)效應Tab. 5 Matrix effects of three kinds of oral smokeless tobacco products

2.8 方法精密度與準確度

選取含有4 種亞硝基氨基酸的口含型樣品1 種，進行方法日內(nèi)及日間精密度實驗。一天內(nèi)進行5 平行實驗以考察方法日內(nèi)精密度，連續(xù)5 天，每天進行實驗以考察方法日間精密度，結(jié)果表明，4 種亞硝基氨基酸的日內(nèi)精密度小6.5%，日間精密度小于9.4%。

在進行方法準確度考察時，考慮到樣品基質(zhì)的差異性，選取口含型、含化型、膠基型口含煙各1種，在高、中、低3 個濃度水平進行加標回收率測定，平行測定3 次，結(jié)果如表6 所示。NSAR、NAzCA、MNPA、MNBA 加標回收率范圍分別在84.2%～102.3%、77.7%～102.3%、90.8%～111% 和89.5%～101.7 %之間。

2.9 部分口含煙樣品中4 種亞硝基氨基酸含量

國內(nèi)目前還沒有口含煙中亞硝基氨基酸含量的報道，國外對口含煙中N-亞硝基氨基酸的文獻報道主要集中在1985 年到1999 年，基本采用的是重氮甲烷衍生GC-TEA 檢測方法。八十年代，Ohshima H等確認了煙草制品中MNPA 及MNBA 的存在，并對瑞典、美國的鼻煙及比利時嚼煙進行了分析，含量范圍分別為0.1～7 μg/g、ND～2.24 μg/g。1988 年，1989年，Tricker AR 等分別對印度zarda、kiwam 口含煙進行了分析NSAR、NAzCA、MNPA 及MNBA 含量范圍分別為ND～0.35 μg/g、ND～0.14 μg/g、0.08～7.8 μg/g、0.008～1.1 μg/g。九十年代，Djordjevic MV 等研究了存儲條件對煙草亞硝基氨基酸含量的影響，結(jié)果表明，隨著存儲時間的延長及存儲溫度的升高，亞硝基氨基酸含量呈增加趨勢。Hoffmann DH、Djordjevic MV 等對瑞典、美國的口鼻煙中的亞硝基氨基酸含量也進行了研究，NSAR、MNPA、MNBA含 量 范 圍 分 別 為ND～0.68 μg/g、1.45～14.03 μg/g、0.01～6.9 μg/g。由此可見，隨著原料及加工工藝的不同，亞硝基氨基酸含量差異較大。

表6 4 種亞硝基氨基酸的加標回收率Tab. 6 Spiked recoveries of the four N-nitrosamino acids

表7 14 個口含煙樣品中四種亞硝基氨基酸的含量 Tab. 7 Contents of the four N-nitrosamino acids in 14 oral smokeless tobacco product samples ng/g

采用本文所建方法測定了14 種不同類型及口味含煙樣品中4 種亞硝基氨基酸含量，結(jié)果如表7 所示。測試結(jié)果表明： 膠基型和含化型制品中未檢出4種亞硝基氨基酸；在其它10 個口含型樣品中，部分檢出NSAR、NAzCA，均檢出了MNPA、MNBA。NSAR、NAzCA、MNPA 及MNBA 檢 出 量 分 別 為ND～128.3 ng/g 、ND～141.6 ng/g 、1687.1～2424.1 ng/g、65.0～199.5 ng/g。與以往文獻相比，袋裝、散裝口含煙四種亞硝基氨基酸含量均在以往所報道的范圍內(nèi)，且偏向于含量范圍的低端，這主要是因為，許多煙草公司致力于產(chǎn)品加工工藝改進，不斷降低有害成分的含量，以至于新產(chǎn)品中有害成分含量顯著低于傳統(tǒng)類型的無煙氣煙草制品（如嚼煙、斗煙、含煙等）[24]。對于新出現(xiàn)的產(chǎn)品類型，如：口含型片劑、膠基型口含煙，由于煙絲用量較少，及加工工藝的改進，四種亞硝基氨基酸均未檢出。

3 結(jié)論

以水為溶劑，萃取口含煙中NSAR、NAzCA、MNPA、MNBA 四種亞硝基氨基酸，經(jīng)BIOTAGE isolute SLE 硅藻土液液萃取柱進行凈化濃縮，建立了簡單、準確的檢測口含煙中4 種亞硝基氨基酸的LCMS/MS 分析方法。4 種亞硝基氨基酸工作曲線相關系數(shù)均大于0.999，檢出限、定量限分別在1.4～5.0 ng/g之間、4.8～18.9 ng/g 之間，回收率均在77.7%～111%之間。用該方法分析國內(nèi)外14 種市售品牌口含煙，結(jié)果表明膠基型和含化型制品中未檢出4 種亞硝基氨基酸；口含型樣品中，部分檢出NSAR、NAzCA，均檢出MNPA 及MNBA ； MNPA 含量最高，范圍為1687.1～2424.1ng/g。該方法前處理簡單，結(jié)果準確，易于推廣應用。