于洋，尹琦，于爽*

(1.牡丹江師范學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157000；2.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650000)

森林作為陸地生態(tài)系統(tǒng)的構(gòu)成主體，它直接關(guān)系到在這個地球生活上的所有生物，與人類更是有著無法分割的聯(lián)系，具有極大的生態(tài)重要性和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。林木遺傳育種在林業(yè)發(fā)展上是永恒的話題，常規(guī)育種的周期性較長是林木遺傳育種的瓶頸問題。1983年，科學(xué)家首次完成了對植物的遺傳改造，使加速植物育種成為可能。1986年，抗除草劑轉(zhuǎn)基因楊樹的問世標(biāo)志著林木基因工程的誕生，迄今為止，已有幾十種林木獲得遺傳轉(zhuǎn)化[1]。

1 林木遺傳轉(zhuǎn)化的方法

理論上基因工程的遺傳轉(zhuǎn)化方法共有十多種，但在林木中實際使用最為廣泛的就是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法，其次是花粉管通道法和電穿孔法。

1.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是將所需的目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中，再利用農(nóng)桿菌侵染植株將T-DNA插入到植物基因組中，使目的基因高效表達(dá)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法不僅價格低廉，而且具有基因沉默現(xiàn)象少、轉(zhuǎn)育周期短和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，這使其成為現(xiàn)代遺傳轉(zhuǎn)化中實用性最強(qiáng)的主導(dǎo)方式。

Nishitani等將目的基因PDS用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化蘋果，獲得的轉(zhuǎn)基因蘋果白化表型與類胡蘿卜素含量均降低[2]；伍寧豐等選取中國南方楊樹N1069為受體材料，利用葉盤法將昆蟲特異性神經(jīng)蝎毒素AaIT基因轉(zhuǎn)化至受體中，轉(zhuǎn)基因楊對舞毒蛾幼蟲有明顯的抗性，致死率顯著高于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓闧3]；饒紅宇等通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)將Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)入楊樹NL-80106，在諸多轉(zhuǎn)化株中，B45和B64對一齡舞毒蛾幼蟲有明顯抗性，轉(zhuǎn)基因楊樹葉片的幼蟲致死率顯著高于對照[4]。

1.2 基因槍法

基因槍法是將目的基因的遺傳片段依附在高速微彈上，利用物理原理通過高速發(fā)射直接使目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞或者受體組織中?；驑尫▽τ谀康幕虻乃拗鬟x擇并無限制，且由于微彈的特殊性，使目的基因的受體作用類型覆蓋面相當(dāng)大。喬利亞等利用基因槍法將Bt基因轉(zhuǎn)入楊樹，并獲得了抗蟲效果明顯的轉(zhuǎn)基因歐洲黑楊[5]；李玲等在對歐洲黑楊的研究中，使用基因槍法導(dǎo)入Barnase基因，最終得到了理想轉(zhuǎn)基因植株[6]；崔旭東用基因槍法將多種抗寒基因和多種功能基因同時整合到歐美楊渤豐1號染色體的遠(yuǎn)端，最終培育出理想的強(qiáng)抗旱轉(zhuǎn)基因楊樹[7]。

1.3 花粉管通道法

花粉管通道法原理是當(dāng)植株子房成功授粉后，通過在其內(nèi)注入含有目的基因序列的核酸，當(dāng)子房開始開花受精時，植株會出現(xiàn)花粉管通道，所導(dǎo)入的核酸就通過花粉管通道將目的基因?qū)胧芫?xì)胞中，使外源基因被整合到受精卵基因組中得以表達(dá)，從而得到新的轉(zhuǎn)基因個體。

花粉管通道法不同于其他分子層面的拼接技術(shù)，整個過程較為簡便，且對實驗環(huán)境要求不高，只要是開花的單子葉或雙子葉林木，無論是多胚還是單胚都可以使用種質(zhì)轉(zhuǎn)化方式，并且可以直接將DNA重組分子導(dǎo)入。通過種質(zhì)轉(zhuǎn)化方式來進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化只能在開花植物的花期進(jìn)行，而且需要大規(guī)模群體化轉(zhuǎn)育。為了提高花粉管通道法在核桃中的轉(zhuǎn)化率，師校欣等用“清香”核桃做材料，采用切割柱頭滴加法、直接滴加法、子房注射法等方式，分別研究了外源基因?qū)胧荏w所需要的時間、基因溶液的最適濃度和導(dǎo)入方式對效率的影響[8]。

1.4 電擊法

細(xì)胞在經(jīng)過瞬時間數(shù)千伏特的高壓電的作用下，細(xì)胞膜發(fā)生去極化，會產(chǎn)生一個20～40 mm的瞬間微孔，當(dāng)微孔產(chǎn)生時，存在在懸液中的外源核酸從細(xì)胞膜上的微孔進(jìn)入，與細(xì)胞內(nèi)的受體細(xì)胞基因整合的過程叫做電擊法。電擊法操作簡便，且作用效果直接高效，自從選用磁性納米顆粒作為外源基因的DNA載體后，其轉(zhuǎn)化效率也變得更高。

McCown 等利用電擊法將外源基因與Bt基因融合并導(dǎo)入雜種楊中，使轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生了對鱗翅目昆蟲的抗性[9]；Liu等利用電擊法將Bt基因?qū)肴A山松中，證明了當(dāng)電擊的受體為成熟的體細(xì)胞胚時，更加有利于外源基因的整合[10]。

2 林木基因工程的應(yīng)用

2.1 植物修復(fù)

工業(yè)的迅速發(fā)展不僅對土壤和水資源帶來了難以恢復(fù)的損傷，遺留的污染物更是給如今的人們留下了大大的難題，并且還存在化學(xué)殺蟲劑殘留所導(dǎo)致的極端土質(zhì)等問題。上世紀(jì)八十年代起運(yùn)用植物處理污染物的設(shè)想首次被提出，污染物治理的方法便開始由物理化學(xué)手段向植物修復(fù)手段進(jìn)行轉(zhuǎn)移，這也為林木應(yīng)用提供了一個育種方向。

柴文嫻獲得的轉(zhuǎn)MT基因的南林895楊樹既可以給具有揮發(fā)性的化學(xué)農(nóng)藥所釋放的碳?xì)浠衔锝舛?，還能夠吸收土質(zhì)中的重金屬元素[11]，是目前退耕還林和礦區(qū)種植的首選樹種類型。Rugh 等獲得的改良汞還原酶(MerA)基因的轉(zhuǎn)基因黃楊可以使高毒的離子汞Hg(II)轉(zhuǎn)化為毒性低毒的元素汞Hg(O)[12]。

2.2 抗病蟲害應(yīng)用

在林木漫長的生長期過程中病蟲害會導(dǎo)致林木生長受到抑制，降低林木存活率，從而造成森林面積的減少?，F(xiàn)今由于人工林的樹種單一，且由無抗性純林組成，使其更容易被病蟲侵害。隨著林木基因工程的發(fā)展，林木抗病蟲害育種方面已有相當(dāng)廣泛和突出的應(yīng)用。

黃艷等將球孢白僵菌中的幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入毛白楊中獲得了抗病轉(zhuǎn)基因株系[13]。自饒紅宇等獲得抗蟲歐洲黑楊后，又相繼有抗舞毒蛾和天幕毛蟲的轉(zhuǎn)基因雜種楊[14]、抗食葉昆蟲的轉(zhuǎn)基因楊[15]和抗鞘翅目昆蟲的741楊等問世[16]。

2.3 抗逆改質(zhì)

通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)拓寬林木生境、拯救極端環(huán)境的植物缺乏和改良林木品質(zhì)，一直是國內(nèi)外林木育種研究中的熱點(diǎn)，現(xiàn)已有諸多報道。

在抗逆方面，繼我國育成首例大田生產(chǎn)的抗鹽堿轉(zhuǎn)基因楊樹—中天楊[17-18]后，楊春霞、姜超強(qiáng)等也相繼獲得了抗旱耐鹽的轉(zhuǎn)基因楊樹[19-20]；Arisi等獲得了抗凍性顯著提升的轉(zhuǎn)基因楊[21]。

在品質(zhì)改良領(lǐng)域，白爽將檉柳lea基因?qū)胄『跅?，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因楊光合效率更高[22]，姜超強(qiáng)將AtNHX1基因轉(zhuǎn)入歐美107楊中，也獲得了光合作用效率更高的轉(zhuǎn)基因植株[23]；張國壁通過轉(zhuǎn)AlaAT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)基因提高了小黑楊固氮效率[24]；Hu等將輔酶A連接酶(4cl)基因轉(zhuǎn)入美洲山楊，轉(zhuǎn)基因楊木質(zhì)素下降了45%，且纖維素增加了15%[25]；Weigel 等將擬南芥Leafy基因轉(zhuǎn)入楊樹中得到轉(zhuǎn)基因楊，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因楊的花期明顯提前[26]；何業(yè)華等將番茄ACC合成酶反義基因?qū)氩煌臈楊惼贩N，最終獲得耐儲存轉(zhuǎn)基因棗類品種[27]。

3 林木基因工程展望

森林作為生態(tài)環(huán)境和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要一環(huán)，所能創(chuàng)造的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)價值是非常巨大的?？傮w看來，林木基因工程具有非常廣闊的發(fā)展空間，當(dāng)前林木基因工程正處于前人開疆，后人擴(kuò)土的絕佳發(fā)展層面，要保持充分的投入，才會保證發(fā)展的可持續(xù)性。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于林木遺傳改良已有幾十年的歷史，但還存在一些技術(shù)問題有待解決，如常用轉(zhuǎn)化手段的轉(zhuǎn)化效率問題、個別樹種轉(zhuǎn)基因體系建立的問題等。此外，轉(zhuǎn)基因物種的安全性問題也不容回避，甚至關(guān)乎林木基因工程的未來發(fā)展和可行性。