吳海濤 陳小忠 趙洪新 申昊 楊朝志 岳翔 張平 王培

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，貴州 遵義 563000)

腦膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，具有高增殖性、侵襲性及易復發(fā)的特點〔1〕。目前臨床治療以手術聯(lián)合放化療為主，但預后較差，患者5年生存率很低〔2〕。雖然腦膠質瘤的發(fā)病機制尚未完全明確，但研究者已發(fā)現(xiàn)腦膠質瘤屬于多基因異常性疾病〔3〕，原癌基因的高表達和抑癌基因缺失共同導致了腫瘤細胞的異常調(diào)控機制〔4〕。軟骨素聚合因子(ChPF)是一種由多種氨基酸構成的跨膜蛋白，在結腸癌、頭部鱗狀細胞癌中存在高表達，且可能介導腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔5〕。ChPF蛋白在腦膠質瘤組織中表達水平明顯高于正常腦組織〔6〕；本實驗以此為基礎，并結合相關文獻〔7～9〕，推測ChPF高表達可能提升腦膠質瘤細胞活性，其作用機制可能與調(diào)控單核細胞趨化蛋白(CCL2)有關。本研究通過重組慢病毒質粒轉染技術下調(diào)人腦膠質瘤A172細胞中ChPF表達，觀察對細胞增殖、侵襲的影響，并進一步下調(diào)細胞中CCL2表達，探討ChPF對CCL2表達的單向調(diào)控機制。

1 對象與方法

1.1主要材料與試劑 人腦膠質瘤細胞系A172購于上?；鄯f生物科技有限公司。攜帶綠色熒光蛋白的載體構建ChPF-shRNA及其陰性對照Nc-shRNA重組慢病毒質粒購于博格隆(上海)生物技術有限公司；CCL2-shRNA及其陰性對照Nc-shRNA重組慢病毒質粒購于上海英駿生物技術有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購于沃卡威(北京)生物技術有限公司；Lipofectamine 3000購于上海索寶生物科技有限公司；CCK-8、Trizol試劑購于武漢艾美捷科技有限公司；鼠抗人ChPF、CCL2、β-actin單克隆抗體購于上海宇淳生物科技有限公司。

1.2重組慢病毒轉染細胞及驗證 使用攜帶綠色熒光蛋的載體構建的重組慢病毒轉染人腦膠質瘤A172細胞，分為空白對照組、Nc-shRNA組、ChPF-shRNA組。主要步驟為：取對數(shù)生長期的A172細胞，按1×106/孔接種于6孔板中，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；觀察細胞融合度超過30%時加入慢病毒轉染，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞中綠色熒光蛋白表達情況，計算熒光細胞所占比例，超過80%后進行后續(xù)實驗。同時使用RT-PCR和Western印跡檢測細胞中ChPF mRNA和蛋白表達水平，其中RT-PCR的ChPF上游引物序列：5′-GAGGACCATGCACGCAAGG-3′，下游引物序列5′-CCATAAGGTCGTGGTAGGGGC-3′。

1.2.1CCK-8法檢測細胞增殖水平 將3組細胞按1×103/孔接種于96孔板中，每孔含100 μl細胞懸液，設置5個復孔，37℃ 5%CO2濃度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用CCK-8法分別測定培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h、96 h的細胞增殖活性，具體為：檢測前2 h每孔鍵入20 μl的CCK-8溶液，常規(guī)培養(yǎng)2 h，上酶標儀讀取450 nm處每孔的吸光度值。

1.2.2流式細胞術檢測細胞周期及凋亡水平 75%乙醇固定3組細胞，加入濃度為1 mg/ml的核糖核酸酶(RNase) A溶液300 μl，常規(guī)培養(yǎng)40 min，加入碘化丙啶700 μl，混合均勻后在4℃避光環(huán)境中染色30 min，上流式細胞儀檢測各細胞周期分布情況。使用上樣緩沖液洗滌3組細胞，重懸后收集沉淀，再使用200 μl緩沖液重懸細胞，滴加10 μl膜聯(lián)蛋白(Annexin)Ⅴ-FITC，4℃避光環(huán)境中靜置20 min，滴加10 μl碘化丙啶，上流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.2.3Transwell細胞侵襲能力檢測 收集轉染48 h的3組細胞消化，使用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸計數(shù)。Transwell小室的上室中加入基質膠60 μl，其中基質膠：DMEM培養(yǎng)基=1∶2，37℃條件下聚合成膠；下室中加入含600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。上室中加入1×105個細胞，37℃ 5%CO2濃度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去上室培養(yǎng)液，擦去未穿膜細胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色10 min，光學顯微鏡下隨機選取10個視野，計數(shù)侵襲細胞數(shù)。

1.2.4CCL2-shRNA轉染細胞后CCL2、ChPF mRNA和蛋白表達水平 取對數(shù)生長期的A172細胞，按1×105/孔接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)至融合度超過30%時，根據(jù)Lipofectamine 3000說明書中的操作方法將CCL2-shRNA、Nc-shRNA轉染細胞，分為空白對照組、Nc-shRNA組、CCL2-shRNA組，并收集轉染36 h后的細胞，使用RT-PCR和Western印跡檢測細胞中CCL2、ChPF mRNA和蛋白表達水平，其中CCL2上游引物序列：5′-CCACTGACCCCGTAACTAA-3′，下游5′-GTTCGTCTTCACCCAAGTCC-3′。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1轉染后各組ChPF mRNA和蛋白表達情況 ChPF-shRNA轉染人腦膠質瘤A172細胞72 h后，熒光顯微鏡下觀察可見多數(shù)細胞中存在綠色熒光，與背景反差強烈，熒光著色細胞輪廓明顯，說明ChPF-shRNA轉染效率高；見圖1。ChPF-shRNA組ChPF mRNA和蛋白相對表達量明顯低于空白對照組和Nc-shRNA組(P<0.01)；ChPF mRNA和蛋白相對表達量在空白對照組與Nc-shRNA組中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1、圖2。

圖1 ChPF-shRNA轉染人腦膠質瘤A172細胞72 h(×400)

表1 各組ChPF mRNA和蛋白表達比較

圖2 Western印跡檢測ChPF蛋白表達

2.2各組細胞增殖能力比較 與空白對照組、Nc-shRNA組相比，ChPF-shRNA組細胞增殖能力明顯減弱，48 h、72 h、96 h時，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；空白對照組與Nc-shRNA組細胞增殖能力之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3各組細胞周期及凋亡率比較 ChPF-shRNA組S期、G2/M期的細胞比例明顯低于空白對照組、Nc-shRNA組，G0/G1期的細胞比例明顯高于空白對照組、Nc-shRNA組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；空白對照組與Nc-shRNA組各細胞周期的細胞比例之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。ChPF-shRNA組細胞凋亡率明顯高于空白對照組、Nc-shRNA組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；空白對照組與Nc-shRNA組細胞凋亡率之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 各組培養(yǎng)不同時間細胞增殖能力比較(OD值，

表3 各組人腦膠質瘤A172細胞周期及凋亡率比較

2.4各組細胞侵襲能力比較 空白對照組、Nc-shRNA組、ChPF-shRNA組穿過小室膜的細胞數(shù)分別為(35.61±5.08)個、(34.38±4.62)個、(15.97±2.69)個。ChPF-shRNA組穿過小室膜的細胞數(shù)明顯少于空白對照組、Nc-shRNA組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；空白對照組與Nc-shRNA組穿過小室膜的細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 Transwell小室檢測各組人腦膠質瘤A172細胞侵襲能力(×200)

2.5各組CCL2 mRNA和蛋白表達情況比較 ChPF-shRNA組人腦膠質瘤A172細胞CCL2 mRNA和蛋白相對表達量明顯低于空白對照組與Nc-shRNA組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；空白對照組與Nc-shRNA組CCL2 mRNA和蛋白相對表達量之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4、圖4。

2.6轉染CCL2-shRNA后對人腦膠質瘤A172細胞中ChPF mRNA和蛋白表達 CCL2-shRNA組CCL2 mRNA和蛋白相對表達量明顯低于空白對照組與Nc-shRNA組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；空白對照組與Nc-shRNA組CCL2 mRNA和蛋白相對表達量之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。ChPF mRNA和蛋白相對表達量在各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5、圖5。

表4 各組CCL2 mRNA和蛋白表達比較

圖4 Western印跡檢測CCL2蛋白表達

表5 各組人腦膠質瘤A172細胞CCL2及 ChPF mRNA和蛋白表達比較

圖5 Western印跡檢測人腦膠質瘤A172細胞中CCL2及ChPF mRNA和蛋白表達

3 討 論

腦膠質瘤惡性程度高、治療預后差，且發(fā)病機制目前仍未完全明確，但基因水平的變異被公認為膠質瘤發(fā)生的根本原因之一，膠質瘤基因水平治療也受到了廣泛關注〔10〕。ChPF是人軟骨素合成酶生成硫酸軟骨素的必要輔助因子，硫酸軟骨素廣泛分布于人體多個組織中，與腦神經(jīng)發(fā)育、感染、炎癥反應密切相關〔11〕，同時還能夠抑制脊髓受損后神經(jīng)軸突的再生〔12〕。提示ChPF可能通過調(diào)節(jié)人體細胞的分化，介導相關疾病的發(fā)生與發(fā)展。相關研究顯示，結直腸癌組織中存在ChPF高表達，且ChPF表達水平與腫瘤分級呈正相關〔13〕；進一步研究發(fā)現(xiàn)，ChPF能夠介導結直腸癌組織中軟骨素合成，在結腸癌中主要發(fā)揮促癌因子作用〔14〕。研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質瘤組織中ChPF表達水平明顯高于正常腦組織〔15〕，提示腦膠質瘤組織中存在ChPF高表達。在此基礎上，本研究使用ChPF-shRNA轉染人腦膠質瘤A172細胞，經(jīng)ChPF mRNA和蛋白檢測顯示細胞中ChPF表達被明顯抑制，提示轉染成功。CCK-8檢測顯示，ChPF表達下調(diào)后細胞增殖能力被明顯抑制；進一步分析細胞周期及凋亡情況顯示，ChPF表達下調(diào)后G0/G1期細胞數(shù)量明顯提升，提示細胞增殖受限，且細胞凋亡比例明顯增加。Transwell小室實驗顯示，抑制ChPF表達能夠有效降低人腦膠質瘤A172細胞的侵襲能力。上述研究結果表明，ChPF表達下調(diào)后，人腦膠質瘤A172細胞的增殖、侵襲能力被抑制，凋亡水平提升。

研究者利用基因芯片技術研究分析發(fā)現(xiàn)，敲除ChPF基因表達后糖皮質激素信號通路受到明顯影響，其中對CCL2的影響最為顯著〔16〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質激素受體能夠通過調(diào)控炎癥反應，介導腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔17〕。如乳腺癌患者體內(nèi)糖皮質激素受體信號能夠激活核轉錄因子(NK)-κB，促進腫瘤細胞的增殖與轉移〔18〕。CCL2屬于促炎癥因子，能夠促進腫瘤細胞聚集相關巨噬細胞，作為趨化因子促進腫瘤發(fā)生與發(fā)展〔19〕。研究證實，炎性微環(huán)境能夠促進腫瘤細胞的增殖與轉化，已被用于抑制腫瘤細胞生長的治療性實驗〔20，21〕。本研究顯示，抑制ChPF表達后，人腦膠質瘤A172細胞中CCL2 mRNA和蛋白相對表達量明顯下降；但抑制CCL2表達后，ChPF mRNA和蛋白表達水平未出現(xiàn)明顯改變；提示ChPF對CCL2表達具有單向調(diào)控作用，ChPF可能通過調(diào)控CCL2表達來影響人腦膠質瘤細胞活性。